犬细小病毒DD分离株的鉴定及基因组序列分析

论文摘要

目的:对本实验室从疑似犬细小病毒感染的发病犬粪便中分离的病毒进行全面鉴定和分型;完成分离毒株的全基因组测序,分析进化变异情况;研究细胞传代过程中分离毒株生物学特性变化和VP2基因的变异关系,为疫苗的研究提供依据。方法:采用同步培养法接种猫肾细胞（CRFK）增殖病毒,通过PCR试验、HA试验、HI试验、IFA试验、电镜观察、动物回归试验和VP2基因测序分析进行病毒的鉴定和分型;通过对分离毒株全基因组测序,并利用DNAstar软件和Web server Uses Mfold（Version 3.2）软件分析本毒株和细胞多次传代获得的CPV-N株基因组的一级结构和二级结构,研究分离毒株的变异情况。将病毒在CRFK细胞上连续传代,对发生典型特征变化的代次进行VP2基因扩增和测序分析,推测VP2氨基酸残基的非同义置换和病毒相关生物学特性改变的关系。结果:经鉴定本实验室分离的病毒为犬细小病毒强毒株,命名为CPV-DD株。对分离毒株进行PCR扩增,可扩增出特异性DNA片段（1163bp）;盲传至第3代时,HA效价为1:8,其血凝性能被特异性抗体抑制;IFA可见特异性亮绿色荧光,TCID50为103.0/0.1mL;电镜观察可见20nm左右的病毒颗粒,动物回归试验表明CPV-DD株F3对犬的致死率为100%,在CRFK细胞传至第18代时,失去对犬的致病力。病毒VP2蛋白序列分析显示该毒株为CPV-2a型,其氨基酸序列在324位出现Try→Ile替换,处于VP2蛋白的潜在抗原表位。病毒的全基因组测序结果显示CPV-DD株F3 3’-UTR仅有一个重复序列,而F18和CPV-N株均有3个重复序列。CPV-DD株F18和CPV-N株的3’-UTR和VP1基因5’端的二级结构较为相似,而CPV-DD株F3和前两者有较大差异。推测CPV-DD株在细胞传代过程中发生的这种改变可能与病毒适应细胞有关。CPV-DD株在CRFK细胞上共传至第33代,对发生典型生物学特征变化代次的VP2基因进行测序分析,其同源性高于97%,从F7代开始VP2氨基酸序列出现87L→M,101T→I,219I→V,297A→S,300G→A,305Y→D点突变,推测上述氨基酸位点的变异可能与细胞适应性、致病力和HA效价改变有关,这一推论有待进一步试验证实。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语中英文对照表
• 第一章 引言
• 1.1 概述
• 1.1.1 犬细小病毒的特性
• 1.1.2 犬细小病毒的分子生物学特征
• 1.1.3 CPV的进化和变异
• 1.2 流行病学研究
• 1.2.1 致病机理
• 1.2.2 分子流行病学研究
• 1.3 CPV诊断方法研究进展
• 1.3.1 传统方法
• 1.3.2 酶联免疫分析技术
• 1.3.3 单克隆抗体（McAb）技术
• 1.3.4 胶体金免疫层析技术
• 1.3.5 微量中和试验
• 1.3.6 聚合酶链式反应（PCR）方法
• 1.3.7 环介导等温扩增（LAMP）技术
• 1.3.8 核酸探针技术
• 1.3.9 核酸杂交技术
• 1.4 免疫预防和治疗
• 1.4.1 免疫预防
• 1.4.2 治疗
• 1.5 研究目的与意义
• 1.6 技术路线
• 第二章 犬细小病毒DD分离株的鉴定和分型
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 病料、细胞和病毒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要溶液与配置
• 2.1.5 试验动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 病料处理
• 2.2.2 病毒培养
• 2.2.3 PCR检测
• 2.2.4 HA与HI试验
• 2.2.5 间接免疫荧光试验（IFA）
• 2.2.6 电镜观察
• 2.2.7 病毒理化性质的鉴定
• 2.2.8 无菌检验
• 2.2.9 支原体检验
• 2.2.10 外源病毒检验
• 2.2.11 动物回归试验
• 2.2.12 毒株分型
• 2.3 结果
• 2.3.1 病毒培养
• 2.3.2 PCR检测结果
• 2.3.3 HA与HI试验
• 2.3.4 间接免疫荧光试验（IFA）
• 2.3.5 电镜观察
• 2.3.6 病毒理化性质
• 2.3.7 无菌检验
• 2.3.8 支原体检验
• 2.3.9 外源病毒检验
• 2.3.10 动物回归试验
• 2.3.11 VP2基因测序和分型
• 2.4 讨论
• 2.4.1 CPV-DD株的细胞培养
• 2.4.2 VP2基因差异与抗原性的关系
• 2.5 小结
• 第三章 犬细小病毒DD株全基因组序列测定及分析
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 CPVDD株F3代浓缩病毒液
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要培养基与配置
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 基因组分段测序
• 3.2.2 3’末端（3’-UTR）测序
• 3.2.3 拼接
• 3.3 结果
• 3.3.1 PCR扩增产物电泳检测结果
• 3.3.2 3’-UTR扩增及胶回收和菌液鉴定结果
• 3.3.3 测序结果及序列拼接
• 3.3.4 基因组结构
• 3.3.5 序列对比分析
• 3.3.6 VP1基因 5’端结构与功能预测分析
• 3.3.7 非翻译区结构与功能预测分析
• 3.4 讨论与小结
• 3.4.1 讨论
• 3.4.2 小结
• 第四章 CPV-DD株种子批的建立及VP2基因变异研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 毒株和细胞
• 4.1.2 主要仪器及试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 建立种子批
• 4.2.2 无菌检验
• 4.2.3 支原体检验
• 4.2.4 外源病毒检验
• 4.2.5 病毒对犬致病力和免疫保护力的测定
• 4.2.6 种子批的冻干保存
• 4.2.7 VP2基因测序及分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 病毒在CRFK细胞上的传代培养
• 4.3.2 病毒HA效价和含量在传代过程中的变化
• 4.3.3 无菌检验结果
• 4.3.4 支原体检验结果
• 4.3.5 外源病毒检验结果
• 4.3.6 动物试验
• 4.3.7 冻干
• 4.3.8 VP2基因扩增和测序
• 4.3.9 VP2蛋白氨基酸序列比对分析
• 4.3.10 构建遗传系统进化树
• 4.4 讨论
• 4.4.1 CPV-DD株在CRFK细胞上的传代变异
• 4.4.2 遗传进化分析
• 4.5 小结
• 第五章 结论与下一步工作设想
• 5.1 结论
• 5.2 下一步工作设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者个人简介