鼠疫耶尔森氏菌LcrV突变体的初步研究

论文摘要

鼠疫是一种自然疫源性的烈性传染病,其病原体为鼠疫耶尔森菌,历史上6世纪、14-15世纪、19世纪发生的3次世界性鼠疫大流行致使超过2亿人丧生,给人类造成了巨大的灾难。近年来随着国际反恐斗争的需要,对鼠疫的防治研究已成为国际生物医学界的研究热点之一低钙反应V抗原（Low-Calcium Response V antigen, LcrV）是鼠疫耶尔森氏菌重要的毒力因子,同时也是鼠疫耶尔森氏菌主要的保护性抗原,它构成了Ⅲ型分泌系统注射体的针尖,调控Ⅲ型分泌系统的分泌,直接产生抗炎症作用,因而在鼠疫菌的感染与免疫中发挥重要作用。V抗原由326个氨基酸组成的,分子量37kDa,其273位氨基酸为半胱氨酸,可以此产生分子间二硫键形成同源二聚体,然而此半胱氨酸残基在感染与免疫中的意义尚未见文献报道。接种鼠疫疫苗已被证明是预防鼠疫的有效手段。目前世界上人用鼠疫疫苗主要有两类,一类是全细胞灭活疫苗,其中甲醛灭活的全菌苗（KWCV）曾在美国获得FDA批准,然而已于1999年停止生产使用；另一类是减毒活疫苗,主要在我国和俄罗斯使用。这两种疫苗虽然安全有效,并曾被长期使用,但都存在一些缺陷,如生产安全性要求高,免疫操作或免疫程序复杂,质控困难等。近年来,国内外都在加紧发展新型鼠疫疫苗,研究发现重组Fl和LcrV抗原都能有效地保护实验动物抵抗鼠疫菌攻击,而二者联用可产生比单独使用更好的效果。由于F1抗原缺失的鼠疫菌仍然具有毒力,所以LcrV抗原的免疫效果对新型亚单位鼠疫疫苗至关重要。美国和英国的鼠疫亚单位疫苗都已进入临床试验阶段。新药研发中的需要对产品质量进行严格控制。V抗原因Cys273的存在导致其出现二聚体形式,虽然根据研究,单聚体和二聚体都具有免疫保护性,二聚体的免疫原性甚至更强,但实际生产过程中增加了质量控制的难度。本研究制备了LcrVm蛋白,对LcrVm与LcrV在理化性质、免疫原性等方面进行比较,研究其作为新型亚单位鼠疫疫苗候选抗原的可行性。大肠杆菌原核表达系统具有遗传背景清楚、技术操作简便、生产周期短、培养条件简单等特点,是最常用的外源蛋白表达系统之一。本研究在我们课题组先前已进行的“V抗原在大肠杆菌系统中的尚效表达”研究基础上,考虑到V来自于原核细胞,分子量比较适中,选择利用大肠杆菌系统表达突变体。首先采用融合PCR的方法,将273位的半胱氨酸密码子进行缺失突变,构建了突变体的基因,将PCR产物克隆到pMD-18T载体上进行核苷酸序列分析,通过Vector NTI与原始序列进行比对,确定获得了预期的突变体基因；再将突变体基因进行双酶切后回收,亚克隆到表达载体pET-32a（+）的相应酶切位点,构建突变体的相应表达质粒；表达质粒进行双酶切鉴定,符合预期后,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态,经过氨苄青霉素筛选,即获得表达突变体的菌株；随机挑取突变体的菌株接种到LB培养基中进行培养,待菌密度OD600达到大约1.5时,加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导,37℃诱导5小时,取诱导后菌液进行SDS-PAGE分析：结果显示,突变体蛋白获得高效可溶表达,大小约37kDa,符合预期,目的蛋白约占蛋白总量的46%[33]。纯化过程中,首先采用phenyl sephroseFF疏水柱,捕获目的蛋白,接着采用脱盐柱去除盐离子,再使用DEAE阴离子柱、phenyl sephrose HP疏水柱、凝胶柱进行精细纯化,去除杂蛋白和内素素,获得纯度大于95%的突变体Vm抗原[2]。蛋白N端氨基酸序列测定显示结果与预期完全一致。获得纯化的蛋白后,采用Western blotting等方法对其进行鉴定,表明V抗原突变体可与抗V单克隆抗体结合。进一步比较鉴定LcrV抗原突变体与LcrV抗原在理化性质等方面的异同。在此基础上,将蛋白使用氢氧化铝佐剂进行吸附[26],在小鼠体内进行了免疫原性研究,通过ELISA检测免疫血清效价,并比较联合免疫组和单独免疫组之间体液免疫反应的差异。结果表明,Vm抗原和V抗原的免疫原性和抗原性没有明显差异；免疫后均产生相应的高效价抗原特异性IgG抗体,协同或干扰较少发生激发的细胞免疫水平相似,均处于较低水平。Vm抗原和v抗原体外理化性质检测结果显示,除了分子量相差约200D以外,其余各项检测指标结果接近。以上测试结果都提示Vm抗原可作为新型亚单位鼠疫疫苗的候选抗原。此外,获得的Vm抗原还将对V抗原结构和功能的研究提供帮助,从而为研究V抗原及其Cys273在鼠疫耶尔森氏菌感染与免疫中的意义奠定基础。

论文目录

• 主要缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 Vm基因克隆、表达载体的构建、目的蛋白表达
• 1.材料和方法
• 2 结果
• 3.小结与讨论
• 第二部分 Vm的发酵、纯化及鉴定
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.小结与讨论
• 第三部分 Vm抗原与V抗原体外理化性质比较
• 1.材料与方法
• 2、结果
• 3.小结与讨论
• 第四部分 Vm抗原和V抗原的免疫原性比较研究
• 1.材料和方法
• 2、结果
• 3.小结与讨论
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录 主要溶液配制
• 附录 发表论著
• 个人简历
• 致谢