原生质体诱变选育漆酶产生菌的研究

论文摘要

杂色云芝1.028（Coriolus versicolor1.028）的原生质体制备过程当中,从酶及其组合、菌龄、渗透压稳定剂三方面进行了研究,以原生质体产量作为衡量的标准,得出杂色云芝1.028制备原生质体的最佳条件:在32℃下,液体静置中培养了6天的菌丝体,以0.6 mol/L甘露醇溶液配制的1%蜗牛酶+1%溶壁酶的混合酶液进行酶解,原生质体的产量最高,达到107个/mL。 用紫外线照射的方法对原生质体进行诱变育种,根据原生质体再生率、紫外线致死率以及正变率三个方面的综合考虑,最后选择了15W紫外灯30cm处照射30s的条件。照射处理后,从中筛选到一株漆酶活力比较高的突变株Cv30-9,酶活达131.72u/mL,比出发菌株（酶活为85.41 u/mL）提高了约50%,传代8次后产酶能力仍然稳定性良好。 rapd研究发现,突变株和出发菌株在电泳图谱中存在特异性扩增带差异,在基因组上存在分子水平遗传差异。电泳图谱中出现的谱带的增加、缺失、以及深浅的变化反映出了基因组上的变化,其多态性频率为40.00%～81.82%。 经过单因子试验设计,得出突变株Cv30-9产漆酶的优化培养条件为:碳源浓度3.0g/L、氮源浓度18mmol/L、初始pH值2.5,250mL三角瓶的装液量为25mL。经过产酶时程的试验,发现Cv30-9在产酶最佳条件下培养至12d漆酶活力达到最高139.32u/mL。 聚丙烯酰胺凝胶电泳发现,突变株和出发菌株在酶的种类和表达量上都存在着差异,这进一步证明了突变株是出发菌株在遗传物质上改变而得到的菌株。 突变株和出发菌株的漆酶活力在不同反应温度下变化较大,二者的最适作用温度比较接近,差别不大。在热稳定性方面,突变株和出发菌株在20℃～45℃之间漆酶稳定性比较好,半失活温度分别为70℃和60℃,二者都比较耐高温。 出发株漆酶最适作用pH是4.0,突变株漆酶最适作用pH是4.5。出发菌株在pH5.0以下稳定性较好,而突变株在pH6.0以下稳定性较好。

论文目录

• 中文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1.1 漆酶的研究概况
• 1.1.1 漆酶的分布
• 1.2 漆酶的组成和性质
• 1.3 漆酶的催化氧化作用
• 1.3.1 催化氧化反应机理
• 1.3.2 底物专一性
• 1.4 漆酶的应用
• 1.4.1 环境保护
• 1.4.2 造纸工业
• 1.4.3 食品工业
• 1.4.4 生物检测
• 1.5 漆酶的分子生物学研究进展
• 1.5.1 漆酶基因的克隆
• 1.5.2 漆酶基因结构和组织分析
• 1.5.3 漆酶基因的异源表达
• 1.6 原生质体技术简介
• 1.6.1 原生质体制备及融合技术的研究进展
• 1.6.2 丝状真菌原生质体制备及融合技术研究进展
• 1.6.3 丝状真菌原生质体诱变系统
• 1.7 RAPD方法在真菌中的应用
• 1.7.1 RAPD技术原理
• 1.7.2 RAPD技术应用
• 第二部分 杂色云芝原生质体诱变与筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 培养基及试剂
• 2.1.3 原生质体的制备
• 2.1.4 分析方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 原生质体的制备
• 2.2.2 紫外线诱变原生质体
• 30-9的遗传稳定'>2.2.3 突变株Cv₃₀-9的遗传稳定
• 2.2.4 RAPD分析
• 2.3 小结与讨论
• 30-9产酶条件的优化'>第三部分 突变株Cv₃₀-9产酶条件的优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种及接种量的制备
• 3.1.2 培养基的组成
• 3.1.3 分析测定方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 主碳源对产酶的影响
• 3.2.2 氮源浓度对产酶的影响
• 3.2.3 培养基初始pH值对产酶的影响
• 3.2.4 培养基装液量对产酶水平的影响
• 30-9漆酶的产酶进程'>3.2.5 突变株Cv₃₀-9漆酶的产酶进程
• 3.3 小结与讨论
• 第四部分 突变株与出发菌株酶学性质比较
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 研究材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.1.4 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 突变株与出发菌株酶种类的比较
• 4.2.2 突变株与出发菌株漆酶最适作用温度的比较
• 4.2.3 突变株与出发菌株漆酶温度稳定性的比较
• 4.2.4 突变株与出发菌株生长速度的比较
• 4.2.5 突变株与出发菌株的PAGE电泳图谱
• 4.2.6 突变株与出发菌株漆酶最适作用pH值的比较
• 4.2.7 突变株与出发菌株漆酶pH值稳定性的比较
• 4.3 小结与讨论
• 参考文献
• 英文摘要