论文摘要
本论文主要对苜蓿中的DREB类转录因子基因进行了研究。分别以4℃寒冷胁迫处理的黄花苜蓿、紫花苜蓿总RNA为模板,运用RACE技术和RT-PCR方法,扩增得到黄花苜蓿逆境胁迫诱导相关转录因子MfDREB1基因、MfDREB1s基因和紫花苜蓿逆境胁迫诱导相关转录因子MsDREB1基因全长cDNA。将以上3个基因cDNA进行克隆与序列分析,序列分析表明MfDREB1基因cDNA长952 bp,包含一个651 bp的开放阅读框,编码一条含216个氨基酸的多肽,分子量约为24.6 kDa,等电点为5.95;MfDREB1s基因cDNA长744bp,包含一个555bp的开放阅读框,编码一条含184个氨基酸的多肽,分子量约为20.8kDa,等电点为9.11;MsDREB1基因cDNA长902bp,包含一个长651 bp的开放阅读框,编码一条含216个氨基酸的多肽,分子量约为24.9 kDa,等电点为6.11。Protein Blast数据显示,以上3条多肽均属于EREBP/AP2家族DNA结合蛋白的典型成员。进一步分别克隆了MfDREB1、MfDREB1s和MsDREB1的基因组DNA,序列分析表明以上3个基因均无内含子。基因组Southern blot分析表明,MfDREB1和MfDREB1s基因在黄花苜蓿基因组中共有3个拷贝,MsDREB1基因在紫花苜蓿基因组中以2拷贝存在。Northern blot结果表明MfDREB1和MfOREB1s基因的表达可受低温胁迫的诱导。拟南芥rd29A基因的表达受干旱、高盐及低温的诱导。rd29A基因启动子区中含有与上述环境胁迫应答相关的DRE顺式作用元件,该启动子可以感受环境胁迫,启动下游报告基因的表达。本研究以拟南芥基因组DNA为模板,扩增得到长937bp的rd29A启动子片段。为下一步外源基因在转基因植物中的诱导表达奠定基础。为建立简便易行、费用低廉的紫花苜蓿基因转化技术,以紫花苜蓿（Medicago sativa L.）为受体材料,以含Gus基因的植物双元表达载体为外源基因供体进行了花粉管通道法转基因的研究。授粉后分别于6h、9h、12h、20h、24h、28h、32h、48h时滴加DNA溶液,待荚果成熟后收获转化种子。对T0代植株进行PCR检测,结果显示授粉后20至48h范围内导入均可得到较高的转化频率,其中授粉后32h滴加DNA溶液所得的转化率最高（16.7%）。本研究对紫花苜蓿组织培养作了系统研究,建立了一套高效稳定的紫花苜蓿再生体系。运用农杆菌介导法将超表达和诱导表达MfDREB1基因的植物双元表达载体pPZP221（35S-MfDREB-nos）、pPZP221（RD29AP-MfDREB-nos）导入紫花苜蓿,PCR检测表明外源基因己整合到受体基因组中。转基因苜蓿中MfDREB1的超表达使得转基因植株的抗寒性比对照植株有所增强。
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中文摘要英文摘要第一章 植物的抗逆性及DREB转录因子的研究进展1.1 植物对逆境胁迫应答的信号传递2+偶联的CDPK和SOS信号传递途径'>1.1.1 与Ca2+偶联的CDPK和SOS信号传递途径2+的MAPK信号传递途径'>1.1.2 不依赖Ca2+的MAPK信号传递途径1.1.3 依赖ABA的信号传导途径和不依赖ABA的信号传导途径1.2 植物对非生物逆境胁迫应答的相关基因1.2.1 在非生物逆境胁迫中直接发挥作用的相关基因1.2.2 调控基因表达的转录因子在植物抵抗逆境胁迫中的作用1.3 植物转录因子的结构与功能1.3.1 植物转录因子的结构1.3.2 植物转录因子的活性1.3.3 植物转录因子的分类及在植物抗逆性中的调控作用1.4 DREB转录因子在提高植物抗逆性中的作用1.4.1 顺式作用元件ABRE和DRE/CRT1.4.2 拟南芥CBF/DREB转录因子的克隆1.4.3 DREB转录因子的表达调控1.4.4 DREB转录因子介导的植物抗逆性参考文献第二章 紫花苜蓿基因工程研究进展2.1 苜蓿在农牧业生产和生态环境建设中具有重要作用2.2 苜蓿生产过程中的困惑2.3 转基因苜蓿培育中常用的转基因技术2.3.1 根癌农杆菌介导法2.3.2 直接转化法2.3.3 花粉管通道法2.4 基因工程手段在苜蓿改良中的应用2.4.1 苜蓿品质改良的基因工程研究2.4.2 苜蓿作为生物反应器的研究2.4.3 苜蓿抗病虫害的基因工程研究2.4.4 苜蓿抗寒、抗旱、耐盐碱的基因工程研究参考文献第三章 拟南芥逆境胁迫诱导表达启动子——rd29A基因启动子的克隆3.1 材料与方法3.1.1 实验材料3.1.2 引物设计3.1.3 rd29A基因启动子片段的扩增及纯化3.1.4 连接反应3.1.5 重组子的转化3.1.6 快速提质粒法筛选重组子3.1.7 重组子的PCR鉴定与测序3.2 结果与分析3.2.1 启动子片段的PCR扩增3.2.2 重组子的筛选3.2.3 重组质粒的PCR鉴定3.2.4 序列分析3.3 讨论参考文献第四章 黄花苜蓿逆境胁迫诱导相关转录因子基因MfDREB1、MfDREB1S的克隆及分析4.1 材料与方法4.1.1 实验材料4.1.2 黄花苜蓿AP2/EREBP保守区的克隆4.1.3 3′-RACE扩增cDNA 3′端序列4.1.4 5′-RACE扩增cDNA 5′端序列4.1.5 黄花苜蓿MfDREB1、MfDREB1s全长cDNA的获得4.1.6 对黄花苜蓿MfDREB1、MfDREB1s差别区的验证4.1.7 基因组DNA Southern杂交4.1.8 Northern杂交4.1.9 基因组中MfDREB1、MfDREB1s基因的分析4.2 结果与分析4.2.1 黄花苜蓿总RNA的提取4.2.2 AP2/EREBP保守区的克隆4.2.3 AP2/EREBP保守区的序列分析4.2.4 cDNA 3′末端扩增4.2.5 cDNA 3′末端序列分析4.2.6 cDNA 5′末端扩增4.2.7 cDNA 5′末端序列分析4.2.8 MfDREB1、MfDREB1s全长cDNA的获得4.2.9 MfDREB1、MfDREB1s全长cDNA的序列分析4.2.10 对黄花苜蓿MfDREB1、MfDREB1s差别区的验证4.2.11 黄花苜蓿基因组DNA的提取4.2.12 基因组Southern杂交4.2.13 Northern杂交4.2.14 基因组中MfDREB1、MfDREB1s基因的分析4.3 讨论参考文献第五章 紫花苜蓿逆境胁迫诱导相关转录因子MsDREB1基因的克隆及分析5.1 材料与方法5.1.1 实验材料5.1.2 引物设计5.1.3 紫花苜蓿总RNA的提取5.1.4 RT-PCR5.1.5 基因组中MsDREB1基因的分析5.1.6 基因组Southern杂交5.2 结果与分析5.2.1 紫花苜蓿MsDREB1基因cDNA的克隆与序列分析5.2.2 紫花苜蓿MsDREB1与黄花苜蓿MfDREB1、MfDREB1s的比较5.2.3 基因组中MsDREB1基因的分析5.2.4 基因组Southern杂交分析5.3 讨论参考文献第六章 紫花苜蓿组织培养体系的建立6.1 材料与方法6.1.1 材料6.1.2 无菌苗的培养6.1.3 愈伤组织的诱导6.1.4 愈伤组织的分化6.1.5 生根培养6.1.6 炼苗移栽6.2 结果与分析6.2.1 基本培养基的选择6.2.2 愈伤组织的诱导6.2.3 愈伤组织的分化6.2.4 再生植株的生根培养6.2.5 再生植株的炼苗移栽6.3 讨论6.3.1 不同基因型紫花苜蓿的再生能力6.3.2 外源激素对紫花苜蓿再生的影响6.3.3 基本培养基对愈伤组织的诱导和分化有较大影响6.3.4 外植体的选择对植株再生的影响参考文献第七章 紫花苜蓿花粉管通道法转基因技术的建立7.1 材料与方法7.1.1 主要试剂7.1.2 植物材料与质粒7.1.3 检测引物7.1.4 质粒DNA的制备7.1.5 植物材料的种植与转化7.1.6 植物总DNA的提取7.1.7 PCR检测7.2 结果与分析7.2.1 转化时间对结荚率的影响7.2.2 PCR检测7.3 讨论参考文献第八章 转MfDREB1转录因子基因cDNA的转基因紫花苜蓿的获得及抗逆性初步分析8.1 材料与方法8.1.1 植物材料8.1.2 主要试剂8.1.3 载体8.1.4 引物8.1.5 MfDREB1基因的PCR扩增8.1.6 载体pPZP221（RD29AP-nos）的构建8.1.7 超表达载体pPZP221（35s-MfDREB-nos）的构建8.1.8 逆境胁迫诱导表达载体pPZP221（RD29AP-MfDREB-nos）的构建8.1.9 根癌农杆菌介导法转化紫花苜蓿8.1.10 再生植株的PCR检测8.1.11 转基因植株抗寒性的初步分析8.1.12 转基因植株抗寒性的分子检测8.2 结果与分析8.2.1 MfDREB1基因的PCR扩增8.2.2 载体pPZP221（RD29AP-nos）的酶切鉴定8.2.3 载体pPZP221（35S-MfDREB-nos）的酶切鉴定8.2.4 载体pPZP221（RD29AP-MfDREB-nos）的酶切鉴定8.2.5 再生植株的PCR检测8.2.6 转基因植株抗寒性的初步分析8.2.7 转基因植株抗寒性的分子检测8.3 讨论参考文献结论下一步研究计划在学期间发表论文致谢
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