大白菜干烧心病致病过程中基因表达序列标签（EST）分析

论文摘要

大白菜（Brassica campestris L. ssp. Pekinensis）原产于中国,是我国蔬菜栽培分布最广、种植面积最大的蔬菜作物之一,也是我国的主要出口创汇蔬菜之一。但是近年来大白菜“干烧心”病却严重影响了其内部质量和出口创汇。由于大白菜资源中缺少抗性材料,以及对植物抗病机制认识的匮乏,干烧心病抗病育种一直是蔬菜育种的重大难题。只有深入研究植物的抗病机制,才能从根本上解决这一问题。大量研究表明此病是由于缺钙引起的生理性病害,不同品种间在抗干烧心病特性上表现出明显的差异,选育抗干烧心病品种已引起育种家的关注。本试验采用离体叶片溶液扦插法,研究了低钙条件下大白菜心叶的抗性及症状表现。进一步运用抑制差减杂交（SSH）技术构建cDNA文库,应用EST技术并与生物信息学分析技术相结合,通过阐明大白菜在干烧心病致病过程中相关基因的表达分析,从基因表达整体水平来研究大白菜抗病机制。离体叶片溶液扦插结果表明:筛选时EDTA-Na2的适宜浓度为2mmol/L,低浓度的EDTA-Na2不能完全排除钙的影响;不同品种对干烧心的抗性有明显差异;发病部位及症状与品种关系密切,不同品种干烧心的发病部位和表现症状有所不同,主要的发病部位集中在叶缘和叶柄;叶片扦插法适合于大量材料的鉴定,此法简单、方便、迅速,是当前干烧心鉴定方法中既经济又实用的一种鉴定方法。抑制差减杂交研究以大白菜干烧心病高感品种B120正常供钙的叶片cDNA为驱动子（Driver）,缺钙处理的叶片cDNA为检测子（Tester）,进行抑制消减杂交,构建了抑制消减文库。在获得的525条具有编码蛋白质功能的EST序列中有428个序列功能已知,74个与推测、假想或功能未知的蛋白质具有很高的同源性。与428条EST具有最高配准的已知功能基因分别来自13个物种。在这个抑制差减cDNA文库中,对获得的已知基因按功能分为12类:初级代谢、能量代谢、细胞生长分裂、转录相关、蛋白质合成、细胞物质降解、转运相关、细胞结构、信号转导、抗病与防御、次生代谢,和其它代谢。说明干烧心病致病过程是一个多因素影响的复杂过程,其中一些基因的表达变化可能在致病过程中起重要作用。这些结果为进一步的干烧心病致病机理研究提供了基础与依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 差异表达基因的研究方法及其应用
• 1.1.1 消减杂交（SH）
• 1.1.2 差异显示技术（DDRT-PCR）
• 1.1.3 cDNA 代表性差异分析（cDNA-RDA）
• 1.1.4 cDNA—AFLP 技术
• 1.1.5 抑制差减杂交（SSH）技术
• 1.2 大白菜干烧心病研究进展
• 1.2.1 大白菜干烧心病发病症状表现
• 1.2.2 大白菜干烧心病发病机理研究
• 1.2.3 大白菜干烧心生理生化变化的研究
• 1.2.4 大白菜干烧心发生过程中叶片超微结构及心叶中钙分布的变化
• 1.2.5 大白菜干烧心病鉴定方法研究
• 1.2.6 大白菜干烧心病抗性与品种关系的研究
• 1.2.7 大白菜干烧心病防治措施的研究
• 1.3 钙对植物生理代谢及功能影响的研究进展
• 1.3.1 钙对细胞膜系统微结构的影响
• 1.3.2 钙对植物细胞壁结构的影响
• 1.3.3 钙的第二信使作用
• 1.3.4 钙对光合系统的影响
• 1.3.5 蛋白质代谢
• 1.3.6 活性氧代谢与膜质过氧化
• 1.4 研究目的及内容
• 第二章 大白菜资源抗干烧心病鉴定研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果和分析
• 2.2.1 干烧心病记载标准及病情指数计算
• 2 溶液培养对大白菜离体叶片干烧心发生的影响'>2.2.2 不同浓度的EDTA-Na₂溶液培养对大白菜离体叶片干烧心发生的影响
• 2.2.3 离体叶片扦插鉴定试验
• 2.3 讨论
• 第三章 大白菜干烧心病致病过程中基因表达序列标签（EST）分析
• 3.1 材料与处理
• 3.2 大白菜干烧心致病过程中抑制差减文库的构建
• 3.2.1 大白菜总RNA 的提取
• 3.2.2 Poly（A）RNA 的分离
• 3.2.3 抑制差减杂交（SSH）
• 3.2.4 差减cDNA 文库的构建（T/A 克隆法）
• 3.2.5 差异筛选差减cDNA 文库
• 3.2.6 cDNA 片段的测序和序列分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 RNA 的提取和mRNA 的纯化
• 3.3.2 双链cDNA 合成与RsaⅠ酶切效率分析
• 3.3.3 消减杂交后两轮PCR 扩增产物结果分析
• 3.3.4 差减cDNA 文库构建及差异筛选
• 3.3.5 差异表达基因的EST 序列分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 SSH cDNA 文库的质量
• 3.4.2 缺钙胁迫下抑制差减杂交文库的特点
• 第四章 结论
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢