论文摘要
水稻草状矮化病毒（Rice grassy stunt virus, RGS V）引起的水稻草状矮化病,简称水稻草矮病,是热带、亚热带稻区的重要病害之一。该病毒引起的症状主要是水稻植株分蘖增多、矮化、新叶褪绿以及锈斑。该病毒可以编码12个蛋白,其中一个是RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）,其余1 1个蛋白为功能蛋白。为了研究该病毒的11个基因与该病毒引起的症状之间的关系,我们将该病毒的各个基因对水稻进行遗传转化,在水稻体内研究草矮病毒的各个基因与水稻植株之间的关系。将RGSV基因构建到PCAMBIA2300-Actin-ocs （PXQ-act）载体上,获得重组子PXQ-P1、PXQ-P2、PXQ-P3、PXQ-P4、PXQ-P5、PXQ-P6、PXQ-PC3、 PXQ-PC4、PXQ-PC5、PXQ-PC6,然后转化农杆菌EHA105,对水稻愈伤进行侵染,随后进行筛选、分化。最后对转基因植株进行PCR鉴定,Southern杂交鉴定,结果获得了P2、P3、P4、P5、PC3、PC5、PC6的转基因阳性植株。其中P3的转基因植株分蘖明显增多,症状与感染RGSV症状相似,这表明P3基因可能与该病毒的致病性直接相关。仅有一株PC5（暂命名为PC5.1）的转基因植株表现了生长发育缓慢、半边叶、卷叶等症状,而其他基因的转基因植株未有明显的表型。利用荧光定量PCR （Real Time PCR）技术检测了P3转基因植株中POL4、 P3基因mRNA的表达量。POL4是与水稻分蘖密切相关的一个基因。结果表明POL4与P3基因的表达量变化趋势一致,两者与水稻分蘖数的变化是负相关。同时为了研究PC5-1的症状是否与PC5基因相关,我们用荧光定量PCR检测了正常的PC5转基因植株与PC5-1中PC5基因的表达量,结果表明PC5的表达量没有差异。然后我们应用反向PCR技术获得了PC5基因在水稻基因组中插入位置的侧翼序列,克隆到一功能未知的水稻基因,命名为nCOX4 。检测nCOX4在PC5-1及其他转基因植株、非转基因植株中的表达量,发现PC5-1中nCOX4的表达被显著的抑制了,结果表明nCOX4可能是水稻形态建成中又一重要的基因。
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摘要ABSTRACT第一章 前言1.1 水稻草状矮化病毒的研究进展1.1.1 水稻草状矮化病的发生和流行1.1.2 水稻草状矮化病毒的基因组结构与功能1.1.3 水稻草状矮化病毒病的诊断及防治策略1.2 植物感染病毒后的症状形成机制研究进展1.2.1 植物感染病毒后的症状形成概况1.2.2 植物感染病毒后的病症形成相关的一些因素1.2.3 植物感染病毒后的症状形成机制的研究现状1.3 水稻遗传转化的研究进展1.4 本研究的目的意义第二章 水稻草状矮化病毒各基因植物表达载体的构建2.1 RGSV各基因的克隆与测序2.1.1 材料与试剂2.1.2 实验方法2.1.3 结果与分析2.2 RGSV各基因过表达水稻载体的构建2.2.1 实验材料2.2.2 实验方法2.2.3 结果与分析2.3 讨论第三章 水稻草状矮化病毒各基因对水稻的遗传转化3.1 材料与方法3.1.1 实验材料3.1.2 试验方法3.2 结果与分析3.2.1 水稻成熟胚愈伤诱导3.2.2 侵染与筛选情况3.2.3 转基因植株的获得3.3 讨论第四章 转基因水稻的分子鉴定及其症状分析4.1 材料与方法4.1.1 实验材料4.1.2 实验方法4.2 结果与分析4.2.1 转基因植株的PCR检测4.2.2 Southern杂交鉴定4.2.3 表型分析4.3 讨论第五章 利用反向PCR技术鉴定畸形转基因水稻PC5-1的侧翼序列5.1 材料与方法5.1.1 实验材料5.1.2 实验方法（反向PCR）5.2 结果与分析5.2.1 反向PCR扩增效果5.2.2 特异条带测序结果分析5.2.3 插入位点的鉴定5.2.4 插入位点的进一步验证5.3 讨论第六章 荧光定量PCR检测转基因植株中PC5、nCOX4、P3、Pol4基因的表达量6.1 材料与方法6.1.1 实验材料6.1.2 实验方法6.2 结果与分析6.2.1 引物特异性分析6.2.2 P3转基因水稻中P3,POL4表达量与分蘖数的关系6.2.3 PC5-1与对照及其它转PC5基因水稻中nCOX4基因的表达量分析6.3 讨论第七章 全文总结7.1 载体构建7.2 水稻的遗传转化7.3 转基因水稻的检测7.4 转基因水稻PC5-1的侧翼序列分析7.5 P3转基因水稻的表型分析7.6 展望参考文献附录1附录2附录3附录4 其它试剂的配置致谢
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