补肾化痰活血法对EAE小鼠少突胶质细胞前体细胞增殖和分化的作用机制研究

论文摘要

目的观察二黄胶囊对EAE小鼠少突胶质细胞前体细胞增殖和分化的影响,应用免疫组化、ELISA、RealTimePCR、Western Blot等方法检测与少突胶质细胞前体细胞增殖和分化相关的各项指标,从组织、分子等不同层面揭示补肾化痰活血法治疗多发性硬化的科学内涵,为中医药辨证治疗多发性硬化提供科学依据。方法SPF级C57BL/6雌性小鼠125只,按体重随机分为正常组（n=25）、模型组（n=25）、激素组（n=25）、二黄大剂量组（n=25）和二黄小剂量组（n=25）。小鼠皮下注射MOG35-55与CFA按1：1混合的抗原,腹腔注射PTX,建立EAE模型,正常组以生理盐水代替。免疫第1天开始,正常组、模型组灌服生理盐水,二黄大剂量组、二黄小剂量组分别灌服相应浓度的二黄浸膏粉悬浊液,从免疫第12天开始,激素组灌服醋酸泼尼松悬浊液。每天记录小鼠体重和神经功能评分,观察发病率、潜伏期、死亡率。于免疫后第23、43天取材,HE染色观察神经病理改变,免疫组化检测Olig2、MBP、GFAP、Caspase3、IGF-1、FGF-2、BrdU的表达,RealTimePCR和Western Blot检测Olig2的基因及蛋白表达,ELISA检测血清及组织匀浆IFN-γ、TNF-α的含量。结果1.造模各组小鼠自免疫第9天开始发病,免疫第21-24天达到高峰,高峰期神经功能评分平均为1.17±0.83。免疫第12天,与模型组比较,激素组、二黄大剂量组小鼠体重增加具有统计学差异（P<0.05）,二黄小剂量组小鼠体重则显著增加（P<0.01）。免疫第16天和22天,二黄小剂量组小鼠体重较正常组、模型组、激素组显著增加（P<0.01）。HE染色大量淋巴细胞聚集在小血管周围,形成袖套样改变,小胶质细胞增多,神经元变性并出现核固缩。2.在侧脑室上部,二黄大剂量组和二黄小剂量组Olig2表达较正常组、激素组、模型组显著增多（P<0.01）；在侧脑室下部,与激素组比较,二黄大剂量组、二黄小剂量组表达显著增多（P<0.01）,和模型组比较,二黄大剂量组表达增多（P<0.05）；在侧脑室内侧,与激素组比较,二黄大剂量组表达显著增多（P<0.01）；在侧脑室外侧,二黄大剂量组表达比正常组、模型组、激素组均显著增多（P<0.01）,二黄小剂量组表达较正常组、激素组显著增多（P<0.01）,较模型组增多（P<0.05）；在脊髓腹侧,同模型组相比,二黄大剂量组、二黄小剂量组表达显著增加（P<0.01）；在脊髓背侧,二黄大剂量组表达较正常组、模型组、激素组均显著增加（P<0.01）,二黄小剂量组表达较模型组显著增加（尸<0.01）。在大脑皮质区和海马CA2区,模型组、激素组、二黄大剂量组、二黄小剂量组MBP表达均较正常组显著减少（P<0.01）；脑白质区,模型组表达较正常组显著减少（P<0.01）,二黄大剂量组较模型组显著增多（P<0.01）。在侧脑室周围,和正常组、模型组相比较,二黄大剂量组GFAP表达显著增多（P<0.01）。在脑白质区,二黄大剂量组、二黄小剂量组Caspase3的表达均较模型组显著减少（P<0.01）。在脑白质区,同模型组比较,二黄小剂量组IGF-1表达增多（P<0.05）,二黄大剂量组表达明显增多（P<0.01）,在脊髓后角,同激素组比较,二黄大剂量组、二黄小剂量组表达显著增多（P<0.01）。在脑皮质区,同正常组比较,二黄大剂量组、二黄小剂量组FGF-2表达明显增多（P<0.01）；在脑白质区,与正常组比较,二黄大剂量组表达增多（P<0.05）,二黄小剂量组表达明显增多（P<0.01）；在脊髓后角,同正常组、模型组、激素组比较,二黄大剂量组、二黄小剂量组表达明显增多（P<0.01）。在侧脑室外侧壁,同正常组比较,模型组、二黄大剂量组、二黄小剂量组BrdU表达增多（P<0.05）；在脊髓腹侧白质,同模型组比较,二黄小剂量组表达增多（P<0.05）,同激素组比较,二黄大剂量组表达增多（P<0.05）,二黄小剂量组表达显著增多（P<0.01）。3.Ⅰ期血清IFN-γ含量,与激素组比较,二黄大剂量组含量降低（P<0.05）。Ⅱ期血清TNF-α含量,与模型组比较,激素组、二黄大剂量组、二黄小剂量组含量显著降低（P<0.01）。Ⅰ期脊髓组织匀浆,模型组IFN-γ含量比二黄大剂量组有明显升高（P<0.05）。Ⅱ期脊髓组织匀浆,与模型组比较,激素组、二黄大剂量组、二黄小剂量组TNF-α含量均有显著降低（P<0.01）。4.Ⅰ期,与正常组比较,二黄大剂量组、二黄小剂量组Olig2的基因表达升高（P<0.05）；与激素组比较,二黄小剂量组Olig2的基因表达升高（P<0.05）,二黄大剂量组显著升高（P<0.01）。Ⅱ期,与正常组和激素组比较,二黄小剂量组Olig2的基因表达升高（P<0.05）。Ⅰ期,与模型组比较,二黄小剂量组Olig2/GAPDH显著降低（P<0.01）。Ⅱ期,与模型组比较,二黄大剂量组Olig2/GAPDH降低（P<0.05）。与Ⅰ期二黄小剂量组比较,Ⅱ期二黄小剂量组Olig2/GAPDH增加（P<0.05）。结论从小鼠发病率、临床表现、神经功能评分、体重变化情况及病理观察等各项指标评价,EAE模型建立成功,可以作为研究MS理想的动物模型。二黄胶囊可以有效改善EAE小鼠临床症状和神经功能评分,降低死亡率,促进神经功能恢复,减轻CNS髓鞘脱失程度。二黄胶囊明显促进小鼠脑和脊髓特定部位少突胶质细胞前体细胞的增殖,显著增加Olig2基因和蛋白表达,促进少突胶质细胞前体细胞的分化,并促进星形胶质细胞的增生和活化,减少凋亡因子的表达,增加CNS各种神经生长因子的释放,为髓鞘的修复和再生提供有利条件。二黄胶囊还可以通过调节多种炎性因子的表达和释放来减轻EAE的炎症反应程度。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 文献综述一 多发性硬化中医病因病机的理论探讨及补肾化痰活血法的临床与实验研究
• 参考文献
• 文献综述二 少突胶质细胞前体细胞对多发性硬化髓鞘修复的作用机制探讨
• 参考文献
• 前言
• 35-55抗原诱导EAE小鼠模型的比较'>实验一 不同剂量MOG_35-55抗原诱导EAE小鼠模型的比较
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二 二黄胶囊对EAE小鼠少突胶质细胞前体细胞增殖和分化的作用机制研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录一:技术路线
• 附录二:实验图片
• 致谢
• 个人简介