Nucleolin在电离辐射诱导的p53变化中的调控作用

论文摘要

Nucleolin（核仁素,又称c23）基因具有多种生物学功能,包括调控核糖体的生物合成与成熟,调控细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程。最近有研究报道Nucleolin可能参与对抑癌基因p53的调控。p53蛋白mRNA的5’端非翻译区（UTR）是Nucleolin和核糖体蛋白26（RPL26）的结合区域,在健康的细胞中Nucleolin优先结合在mRNA的5’端非翻译区,p53的合成受到抑制,当DNA损伤时RPL26就优先结合于5’端非翻译区,增加p53转录的几率。本实验采用分析细胞学及分子生物学手段,对电离辐射作用于人乳腺癌细胞MCF-7后Nucleolin蛋白的表达、分布的影响及其对p53的调控进行研究。胞浆、胞核及总蛋白的时程、量效实验表明,4 Gy X射线照射4 h后,Nucleolin和p53表达量增加,并发生了由胞核到胞浆的穿梭,24 h后又基本恢复照射前水平;通过p53沉默实验表明,Nucleolin在4 Gy X射线照射4 h后开始下降,直至48 h仍处于低表达水平;本实验也发现Nucleolin的穿梭并不完全依赖于Nucleolin-p53复合体形成,但还需要进一步实验来确定其其它出胞途径;同时Leptomycin B的作用对Nucleolin和p53总量没有影响,但可以增加电离辐射诱导的蛋白穿梭,其机制有待于进一步深入探究。蛋白滞后实验表明:Nucleolin和p53 N末端的结合活性在4 Gy照射4 h和8 h后结合活性最弱,同时电离辐射可以使Nucleolin和p53互相控制减弱。以上结果将为揭示电离辐射对p53信号传导通路的影响提供重要的细胞学基础,并为辐射细胞效应研究提供新的生物学依据。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩写
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 核仁素
• 1.1 核仁素的概念
• 1.2 核仁素的结构
• 1.3 核仁素的细胞定位
• 1.4 核仁素的特性
• 1.5 核仁素的生物学功能
• 2 P53 抑癌基因
• 2.1 p53 家族基因
• 2.2 p53 基因的功能
• 3 Nucleolin、P53 与电离辐射
• 4 本课题深入研究的前景展望
• 第二章 材料与方法
• 1 主要试剂及器材
• 1.1 试剂
• 1.2 器材
• 2 主要仪器
• 3 细胞株
• 4 细胞培养试剂的配制
• 4.1 DMEM 培养液
• 4.2 小牛血清的配制
• 4.3 胰酶配制
• 5 照射条件
• 6 细胞样本的处理
• 6.1 试剂配置
• 6.2 步骤
• 7 流式细胞术（Flow cytometry, FCM）
• 7.1 蛋白表达的检测
• 8 蛋白质的提取（在冰上进行）
• 8.1 试剂配置
• 8.2 胞浆蛋白的提取
• 8.3 胞核蛋白的提取
• 8.4 细胞总蛋白的提取
• 9 蛋白质浓度的测定
• 10 蛋白质免疫印记法（Western Blot）
• 10.1 试剂配制
• 10.2 凝胶制备
• 10.3 SDS-PAGE 电泳
• 10.4 转膜及封闭
• 10.5 抗体的杂交
• 10.6 暗室曝光
• 11 构建P53-/-细胞模型
• 11.1 RNAi 载体
• 11.2 试剂准备
• 11.3 步骤
• 12 Leptomycin B 的出核抑制
• 12.1 Leptomycin B 存储液配置
• 12.2 药物浓度及作用时间
• 13 逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 13.1 HEK-293 细胞总RNA 的提取及定量
• 13.2 逆转录（RT）
• 13.3 引物设计
• 13.4 聚合酶链式反应（PCR）
• 13.5 琼脂糖凝胶电泳
• 14 PCR 产物的酶切及载体构建
• 14.1 PCR 产物及载体的酶切
• 14.2 酶切产物电泳切胶回收线性载体
• 14.3 载体构建
• 15 载体的扩增
• 15.1 感受态DH5α的制备
• 15.2 细菌的转化
• 15.3 质粒的提取
• 15.4 质粒的纯化（酚－氯仿抽提）
• 16 蛋白滞后实验（Protein Supershift）
• 16.1 试剂配制
• 16.2 凝胶灌制
• 16.3 上样体系准备
• 16.4 电泳后转膜，后续实验同Western Blot
• 17 统计分析
• 第三章 实验结果
• 1 电离辐射对MCF7 细胞Nucleolin 和P53 蛋白表达的影响
• 1.1 蛋白时程变化分析
• 1.2 蛋白量效变化分析
• 2 构建MCF7-P53-/-细胞模型的鉴定
• 3 电离辐射对MCF7-P53-/-细胞Nucleolin 蛋白表达的影响
• 3.1 蛋白时程变化分析
• 3.2 蛋白量效变化分析
• 4 Leptomycin B 出核抑制后的蛋白表达影响
• 4.1 蛋白时程变化分析
• 4.2 蛋白量效变化分析
• 5 电离辐射对Nucleolin 的DNA 结合活性的影响
• 5.1 PCR 产物鉴定
• 5.2 电离辐射对Nucleolin 的DNA 结合活性的时程影响
• 5.3 电离辐射对Nucleolin 的DNA 结合活性的量效影响
• 第四章 讨论
• 1 电离辐射作用后Nucleolin 和P53 表达变化
• 2 P53 沉默后的Nucleolin 蛋白变化
• 3 Leptomycin B 作用后的Nucleolin 和P53 蛋白变化
• 4 P53 和Nucleolin 结合活性检测
• 5 研究展望
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 导师简介
• 个人简历及成果
• 致谢