论文摘要
越来越多的证据表明,肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）是恶性肿瘤发生、进展和复发的“根源”。近年来,研究者对该亚群细胞的增殖与分化、治疗抵抗、侵袭转移能力、免疫逃逸、缺氧耐受以及诱导血管新生等重要生物学特性进行了深入、细致的观察,相关研究结果正深刻地改变着我们对恶性肿瘤发生、侵袭/转移、治疗耐受以及复发的认识。然而,目前对于CSCs线粒体及其相关的能量代谢特征,尚缺乏相关的研究。线粒体是维持真核细胞生存的重要细胞器之一,主要负责将营养物质转换成能量分子--三磷酸腺苷（ATP）,从而为细胞活动提供能量,在细胞增殖、凋亡、类固醇代谢、钙平衡的调节等生理活动中扮演着不可或缺的角色,其功能和结构异常与恶性肿瘤的发生和进展密切相关;而更为有趣的是,最近研究结果表明,线粒体的形态、分布、数量以及相关能量代谢参数,对调控正常干细胞的自我更新、多潜能性以及增殖/分化等具有重要的作用。因此,观察CSCs线粒体及相关能量代谢特征,有助于我们深入地认识CSCs的生物学特性,同时,鉴于CSCs在恶性肿瘤中的核心地位,这也将有助于我们更加全面的了解恶性肿瘤肿瘤的发生、发展和复发。本课题在从肺腺癌A549细胞系中分离和鉴定肺癌干细胞（lung cancer stem cells, LCSCs）的基础之上,观察LCSCs线粒体的数量/空间分布、线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）拷贝、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,△ψm）,葡萄糖消耗、氧耗量以及细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）和ATP浓度。并初步探讨了肺癌细胞群体△ψm异质性在分离和富集LCSCs中的作用。研究结果可为深入了解LCSCs的生物学特性提供新的实验依据。目的1.从肺腺癌A549细胞系中分离鉴定LCSCs。2.探讨LCSC细胞亚群线粒体能量代谢的生物学特性变化。3.探讨利用△ψm异质性进行分离和富集LCSCs的可行性。实验方法1. LCSCs的分离、培养及鉴定肺腺癌A549细胞低密度培养于含血清培养基,克隆形成后,挑选紧密性克隆细胞置于改良的无血清干细胞培养基中培养出肺癌干细胞球（sphere）;免疫荧光激光共聚焦显微镜检测其干细胞相关标志物的表达情况;Real-time PCR检测干细胞相关标志物mRNA的转录情况;将其置于含血清分化培养基中,免疫荧光激光共聚焦显微镜检测子代细胞中干细胞标志物和分化标志物表达改变的情况;皮下接种于裸鼠,观察成瘤能力;取移植瘤标本,行HE染色观察其病理学特征,并行免疫荧光激光共聚焦显微镜检测,观察相关标志物的表达情况。2. LCSCs线粒体及能量代谢特性的观察2.1以Mito-Tracker Green（线粒体绿色荧光探针）标记细胞线粒体,细胞膜红色探针1,1-十八烷-3,3,3,3-四甲基印度羰花青高氯酸盐（1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl indocarbocyanine perchlorate,DiI）标记细胞膜,激光共聚焦观察A549细胞线粒体空间分布形态。2.2以Mito-Tracker Green标记细胞线粒体,Hoechst 33342标记细胞核,激光共聚焦观察A549细胞中侧群（side population,SP）细胞和非SP细胞线粒体空间分布和线粒体数量;并以Mito-Tracker Green标记细胞线粒体后,流式细胞术比较LCSCs、无血清单层贴壁细胞（monolayer）、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的线粒体数量。2.3以Real-time PCR方法检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的线粒体DNA拷贝数。2.4以罗丹明123（Rh123,△ψm探针）标记细胞线粒体,流式细胞术检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的△ψm。2.5以荧光素-荧光素酶方法,检测检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的ATP浓度。2.6以荧光探针DCFH-DA标记ROS的方法,流式细胞术检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的ROS浓度。2.7以葡萄糖氧化酶法,通过酶标仪检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞在无血清培养下,和A549细胞系分别在10%胎牛血清的DMEM培养基及无血清培养下,各组细胞在24h和48h的的葡萄糖消耗量。2.8提取LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的线粒体,采用Clark-type氧电极法测定线粒体呼吸控制率（respiration control of rate,RCR）观察线粒体氧耗情况。3.△ψm的异质性在分离/富集LCSCs中的应用3.1 LCSCs与普通肺癌细胞△ψm异质性的检测以Rh123和JC-1（△ψm探针）标记细胞线粒体,Hoechst 33342标记细胞核,激光共聚焦分别比较A549细胞中SP细胞和非SP细胞△ψm异质性;以JC-1标记细胞线粒体,流式细胞仪检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞及A549细胞系△ψm异质性。3.2△ψm的异质性在分离/富集LCSCs中的应用以Rh123标记A549细胞线粒体后,流式细胞仪分选5%最高△ψm和5%最低△ψm两组细胞;以免疫荧光激光共聚焦显微镜检测两组细胞干细胞标志物的表达情况;以克隆形成实验评估两组细胞在无血清培养基和含血清培养基中自我更新能力;皮下接种于裸鼠,观察两组细胞成瘤能力。结果1.成功地从肺腺癌A549细胞系中获得LCSCs亚群。1.1成功获得具有自我更新能力的干细胞球。挑选A549细胞中紧密型克隆于无血清干细胞培养基中培养,成功获得了呈球状生长的第一代肺癌干细胞球;将其吹散后重新接种于无血清干细胞培养基中,能够再次形成第二代肺癌干细胞球;1.2干细胞球表达多种干细胞标志物。免疫荧光激光共聚焦显微镜检测显示肺癌干细胞球表达CD133、CD44s、stem cell antigen-1 （Sca-1）、Nanog、sex determining region Y-box 2 （Sox2）和octamer-binding transcription factor 4 （Oct4）干细胞标志物。干细胞标志物CD34、c-kit、Twist1、Sox2、Oct4、Nanog和CD133的mRNA也在肺癌干细胞球高表达,较无血清单层贴壁细胞高2倍以上。1.3干细胞球具有多向分化能力。将肺癌细胞球置于含10%胎牛血清的分化培养基中,检测其分化前、后干细胞标志Sca-1和分化标志clara cell secretory protein （CCSP）、prosurfactant protein C （SP-C）的表达,结果显示肺癌细胞球分化的子代细胞类似于A549细胞系。1.4干细胞球具有免疫缺陷动物成瘤能力。裸鼠皮下成瘤实验显示,肺癌细胞球所形成肿瘤较无血清单层贴壁细胞形成肿瘤生长更快,后者三周后始见皮下肿瘤形成。移植瘤HE染色结果显示:来源于A549肺癌干细胞的皮下移植瘤中心有更多的坏死,癌细胞小,呈边缘棘突状多边形,胞浆少,分泌黏液多,细胞核深染,且数量众多,形态多样,癌细胞排列呈小腺管状。此外,细胞间质中可见众多的微血管形成。而来源于无血清单层贴壁细胞的皮下移植瘤中,尽管其癌细胞的大小、形态和分化状态类似于肺癌细胞球肿瘤的癌细胞,但显示更少的局部坏死灶、腺管样结构和微血管形成。此外,来源于A549细胞系形成的的皮下移植瘤中见癌细胞形态大而圆,胞浆丰富,癌组织中血管密度很低,无腺管样结构,提示,肺癌干细胞所形成的肿瘤最接近于原发肿瘤的病理学特性;免疫荧光激光共聚焦显微镜检测结果显示,来源于肺癌干细胞的移植瘤表达Sca-1、CCSP、SP-C标志物。2. LCSCs亚群呈现出不同于分化肺癌细胞的线粒体及能量代谢特征。2.1 LCSCs胞浆内线粒体以绕核分布为主。激光共聚焦显微镜显示,A549细胞内线粒体主要有绕核分布（perinuclear,P）、平均分布（homogeneous,H）和聚集分布（aggregated,A）3种空间分布形式。其中SP细胞更多表现为线粒体绕核分布（P,0.33;H,0.37;A,0.30）,而在非SP细胞中,大部分都表现为线粒体聚集分布（P,0.07;H,0.33;A,0.60）。2.2 LCSCs与非LCSCs线粒体数量无明显差异。激光共聚焦显微镜观察显示,A549细胞中SP细胞和非SP细胞线粒体MitoTracker Green荧光强度无明显区别（SP,54.14±15.5;non-SP,45.08±11.2,P>0.05）。流式细胞术检测也发现LCSCs、无血清单层贴壁细胞的线粒体平均荧光强度无明显差异（sphere,46.3;monolayer,46.9）。提示A549细胞中LCSCs和非LCSCs间线粒体数量无明显区别。2.3 LCSCs的mtDNA拷贝数低。Real-time PCR检测结果显示,LCSCs的mtDNA拷贝数（Cox I/β-actin值）较无血清单层贴壁细胞低下（sphere,0.20±0.03,monolayer,0.11±0.02,P<0.01）;并且LCSCs分化后第1-8天mtDNA拷贝数急剧增多。2.4 LCSCs的△ψm高于非LCSCs。流式细胞术检测发现,LCSCs的Rh123荧光强度高于无血清单层贴壁细胞（sphere,135.3;monlayer,73.4）;并且LCSCs分化后,其Rh123荧光强度在12h内上升后,2天后再下降。2.5 LCSCs胞浆内ATP浓度低于非LCSCs。LCSCs的ATP的浓度较非LCSCs低（sphere,1.99±0.15μmol/L/mg;monolayer,3.06±0.92μmol/L/mg;cell line,3.86±1.73μmol/L/mg,P<0.05）。A549细胞球分化后,ATP的浓度也是再在2天内明显上升后,再逐步下降,4周后接近A549细胞系的ATP浓度水平。2.6 LCSCs胞浆内ROS浓度以及葡萄糖和氧耗量均低于非LCSCs。LCSCs的ROS浓度明显低于非LCSCs（sphere,13.9;monolayer,23;n=3×104）;LCSCs分化后,ROS短时间内（<12hour）急剧升高,此后稍下降并再次升高至A549细胞系水平。同时,LCSCs葡萄糖消耗亦低于非LCSCs（sphere,48 hour,6.11 mmol/L;monolayer,48 hour,10.76 mmol/L;cell line,48 hour,9.70 mmol/L）。此外,A549细胞球还表现比无血清单层贴壁细胞更低的氧耗量（sphere,1.46±0.16;monolayer,2.52±0.72;P<0.05）。当A549细胞球分化后,其氧耗量缓慢增加。3.肺癌细胞△ψm异质性可作为分离/富集LCSCs的工具3.1肺癌中各细胞亚群具有△ψm的异质性。激光共聚焦显微镜观察A549细胞△ψm,SP细胞Rh123荧光强度高于非SP细胞;SP细胞JC-1的590/520荧光强度比值也高于非SP细胞;流式细胞仪检测A549干细胞球JC-1的590/520荧光强度比值高于无血清单层贴壁细胞,以上结果都提示在肺癌细胞群体中表现△ψm异质性,且LCSCs细胞△ψm高于非LCSCs细胞。3.2△ψm异质性可用于分离/富集LCSCs。经Rh123标记A549细胞线粒体后,流式细胞仪可分选出最高（H△ψm）、最低（L△ψm）各5%的两群细胞。共聚焦观察到CD133表达在H△ψm的细胞上荧光强度高,而在L△ψm的细胞上不易被观察到;H△ψm细胞的无血清细胞球和有血清细胞克隆的形成率都明显分别高于L△ψm细胞,且形成克隆体积更大,细胞排列紧密。提示H△ψm A549细胞具有更多的干细胞特性。结论1.成功地从肺腺癌A549细胞系中获得了表达多种干细胞标志物,具有自我更新、多向分化以及免疫缺陷动物成瘤能力的LCSCs亚群。2. LCSCs亚群呈现出不同于分化肺癌细胞的线粒体及能量代谢特征。包括:线粒体以绕核分布为主、低mtDNA拷贝数、高△ψm、胞浆内ATP/ROS浓度低、低葡萄糖和氧耗量。3.肺癌细胞群体中△ψm的异质性可作为分离/富集LCSCs的一个潜在工具。
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