新型毛细管电泳方法在药物分析和蛋白质分离中的应用

论文摘要

毛细管电泳（CE）是一种具有高效、快速、进样少、成本低、污染少、自动化高、分析对象广等优点的分析检测方法,广泛地应用在药物、蛋白质分析等领域,已成为现代生命科学的一种非常重要的分离分析技术。在本文的工作中,我们着眼于解决毛细管电泳技术上所面临的一些问题,如灵敏度不够高,分析物在毛细管壁的非特异性吸附等问题。我们使用在线富集技术来提高毛细管电泳在药物分析中的灵敏度,使用表面活性剂涂层方法来抑制蛋白质在毛细管管壁的吸附,改善其分离效果。围绕这些目标本文主要开展以下几方面的工作:（1）利用毛细管电泳-大体积进样（CE-LVSS）的方法完成对抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶（5-FU）及其前药替加氟（TF）的在线检测。最佳的电泳缓冲液为pH 8.0的30 mM磷酸盐溶液。不使用大体积进样时,5-FU和TF的检测限（LOD）分别是600.5 ng/mL,771.4 ng/mL;采用大体积进样后,其灵敏度提高约两个数量级（5-FU和TF的检测限分别降低到7.9 ng/mL,6.5 ng/mL）;相对标准偏差%RSD小于5%。与其他报道过的分析5-FU和TF的分析方法相比,该法具有明显的优越性（高灵敏度,高选择性,分析时间短）,并成功应用于抗肿瘤药物的商用注射液的定量分析。结果证明毛细管电泳-大体积进样是一种简单、快捷、高选择和高灵敏的方法。（2）表面活性剂半永久涂层能有效防止蛋白质在毛细管的管壁吸附。但是,由于缓冲液的冲洗致使表面活性剂在管壁脱落,是半永久涂层所面临的问题。本文提出一种简单通用的方法来改善表面活性剂半永久涂层的稳定性,该方法是在涂层里添加带相反电荷的表面活性剂。选用双十二烷基二甲基溴化铵（DDAB）和一种双子表面活性剂,18-6-18作为半永久涂层,十二烷基硫酸钠（SDS）作它们的对电荷表面活性剂。SDS可以改变阳离子表面活性剂的堆积参数P,并从而调整涂层的稳定性。加大SDS在涂层里浓度,涂层的稳定性先增大后减小。在最佳的SDS浓度下,可以得到非常稳定的涂层,在138 kPa高压冲洗60 min,电渗流（EOF）仅改变3.6%。这种SDS增强的涂层在分离蛋白质时表现出很好的稳定性和重现性（日内迁移时间的相对标准偏差（RSD）<1.1%,n=9）。再者,被测蛋白质的高分离效果和回收率证明这种涂层具有很强的抑制管壁吸附的能力。最后,我们发现蛋白质的分离效率,比传统的EOF值,更能准确的指示涂层的稳定性。（3）提出了一种CE同时分离酸碱性蛋白质的简单方法。该方法利用阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）来构建巨型胶束网络结构作为伪固定相来同时分离十种常见的酸碱蛋白质。随着CTAB浓度的增加,胶束的形貌由球形胶束转变为复杂的巨型胶束网络。这种表面活性剂巨型胶束网络能够提供更强的疏水空间来与蛋白质相互作用,从而能够有效地减少蛋白质与毛细管壁的作用,抑制蛋白质在毛细管壁的吸附,从而实现高效的酸碱蛋白质同时分离。这种巨型胶束网络的伪固定相在分离蛋白质时表现出很好的稳定性和重现性（日内迁移时间的相对标准偏差（RSD）<1.22%,n=9）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 毛细管电泳简介
• 1.1.1 毛细管电泳的原理
• 1.1.2 毛细管电泳的特点
• 1.1.3 毛细管电泳的分离模式
• 1.2 毛细管电泳在生命科学的应用
• 1.2.1 毛细管电泳在药物分析中的应用
• 1.2.2 毛细管电泳在蛋白质分析中的应用
• 1.3 毛细管电泳面临的问题及解决的方法
• 1.3.1 毛细管电泳面临的问题
• 1.3.2 解决方法
• 1.4 本文构思
• 第2章 毛细管电泳-大体积进样法检测5-氟尿嘧啶及其前药替加氟
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 电泳步骤
• 2.2.4 大体积进样
• 2.2.5 标准曲线
• 2.2.6 实际样品的准备
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 富集步骤的优化
• 2.3.2 5-氟尿嘧啶和替加氟的定量分析
• 2.3.3 对其他物质的抗干扰作用
• 2.3.4 应用
• 2.3.5 与其他方法比较
• 2.4 本章小结
• 第3章 基于混合阴阳离子表面活性剂的半永久涂层用于毛细管电泳蛋白质分离
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 EOF 的测定
• 3.2.4 涂层稳定性实验
• 3.2.5 蛋白质的分离
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 SDS 对表面活性剂半永久涂层的影响
• 3.3.2 用SDS 增强的半永久涂层进行蛋白质分离
• 3.4 本章小结
• 第4章 巨型胶束网络用于毛细管电泳同时分离酸碱蛋白质
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验试剂
• 4.2.2 实验仪器
• 4.2.3 透射电镜观察
• 4.2.4 蛋白质分离
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 分离机理解析
• 4.3.2 CTAB 浓度的影响
• 4.3.3 pH 值的影响
• 4.3.4 离子强度的影响
• 4.3.5 温度的影响
• 4.3.6 蛋白质分离
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢