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新疆野生酵母的分离鉴定

2020-12-10阅读(292)

新疆野生酵母的分离鉴定

论文摘要

1、本文对新疆的南北疆部分地区的水果及南疆胡杨林的土壤中可培养的酵母菌进行研究,采用富集培养法结合划线分离技术,从7处采样点得到的样品,分离纯化出31株酵母菌。其中从乌鲁木齐采集的水果中分离得到9株;吐鲁番采集的无核白中仅分离得到1株,从和田采集的绿桃中分离得5株;从莎车采集的阿木提中分离得到3株;从喀什采集的无花果中分离得到5株;从轮台的胡杨林土壤中分离得到3株;从沙雅的胡杨林土壤中分离得到5株酵母。结合酵母传统形态学观察及生理生化,扩增核糖体rDNA基因间区ITS和D1/D2区的序列,测序后与国际核酸数据库GenBank/EMBL/DDBJ中已提交的相类似物种的核酸序列进行BLAST比对,确定实验菌株与其最近缘种的同源性来判断物种的归属。同时,运用CLUSTAL W软件比对所有近似物种,MEGA 4.0构建系统发生进化树,采用数值分类法进一步确定物种的归属。表明,这些菌株分属6个属10个种,其中Pichia属和Issatchenkia属各8株,各占总分离菌的25.8% , Cryptococcus属6株,Saccharomyces属5株, Rhodosporidium属1株。其中从胡杨林土壤分离得到8株Pichia属酵母。可见胡杨林土壤中Pichia属占主要地位。Issatchenkia、Cryptococcus、Saccharomyces在新疆是比较常见的酵母。2、酵母的生理生化表明,所分离的菌株中有18株酵母能够在40℃时生长,占分离菌株的58%;21株能够在含10%NaCl的培养基上生长,占分离菌株的67.7%;12株能够在含100mg/L的放线菌酮培养基上生长,占分离菌株的38.7%。而这些特征都与酵母耐受不良环境相关,并发现具有这些特征的酵母菌株大多分离于南疆的样品,说明这些特征可能与酵母适应南疆恶劣环境相关。3、根据26S rDNA D1/D2区序列分析,初步认为菌株编号为KK18和KK20的菌株有新种的可能性（98%）。通过Biolog对菌株进行生理生化检测,然后进行酵母的脂肪酸分析。然而遗憾的是由于这两株酵母的D1/D2区测序后长度仅为377bp及386bp,而数据库中的序列较长（>2000bp）,并且5.8S ITS区序列实验多次均无法得到,且Biolog及全细胞脂肪酸分析均没有与之相匹配的结果,因而无法准确对菌株进行鉴定,仅能将其鉴定到Pichia属。4、菌株KK25由于具有桔红色的色素,采用酸热法对菌体进行破壁,然后用丙酮提取色素,得到的粗制品在可见光下进行全波长扫描,发现色素含量很低,未进行进一步的分离提纯;由于该菌株在YEPD培养基上28℃培养5-6天后,菌落几乎没有活性,设计试验检测发现在含4%NaCl的YEPD培养基上该酵母能够较长时间生存并能维持正常的生长繁殖。这种在不含盐的培养基上无活菌体,而在含盐的培养基上则呈现出有活菌的现象,表明该菌株的正常生长繁殖对盐具有依赖性。KK25是Rhodosporidium paludigenum,是一种海洋拮抗酵母,该株酵母对盐具有依赖性。5、分离及鉴定一株来自于新疆塔城民间自制酸梅酱中的酵母菌。采用NL1/NL4引物对扩增酵母菌株的26S rDNA D1/D2区,测序结果进行序列分析,用Neighbour-joining（N-J）方法构建系统发育进化树。同时结合酵母的传统形态学鉴定对菌株进行鉴定。发现其26S rDNA D1/D2区序列分析表明菌株KKS与Metschnikowia aff. fructicola D3895相近,相似率为99.2%。在N-J法构建的系统发育进化树中,菌株KKS与Metschnikowia aff. fructicola聚类在同一分枝上。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1 新疆的地理地貌特点与微生物资源量
  • 2 酵母的用途
  • 2.1 酵母在生活中的用途
  • 2.2 酵母在酿酒中的用途
  • 2.3 酵母在工业上的用途
  • 2.4 酵母在养殖业中的用途
  • 2.5 酵母细胞成分及代谢产物的用途
  • 2.6 酵母在保护环境中的用途
  • 2.7 酵母在基础研究中的用途
  • 3 新疆酵母的研究进展
  • 4 酵母菌现代分类技术进展
  • 4.1 基于生理生化检测的快速鉴定
  • 4.1.1 API 20C AUX 系统
  • 4.1.2 Biolog 微生物鉴定系统
  • 4.2 基于细胞结构的酵母鉴定
  • 4.2.1 可溶性蛋白质凝胶电泳
  • 4.2.2 酵母细胞壁组分分析
  • 4.2.3 傅里叶变换红外吸收光谱（FT-IR）显微分光仪分析
  • 4.3 核糖体DNA 鉴定法
  • 4.3.1 26S rDNA D1/ D2 序列
  • 4.3.2 18S rDNA 基因序列
  • 4.3.3 5.8S ITS 区
  • 4.3.4 5 SrDNA/ rRNA
  • 4.3.5 IGS rDNA 基因序列
  • 4.4 DNA-DNA 杂交
  • 4.5 基于指纹技术的酵母鉴定
  • 4.5.1 RFLP 分析法
  • 4.5.2 RAPD 分析法
  • 5 总结
  • 第二章 酵母的分离鉴定
  • 1 材料
  • 1.1 采样地点及样品类型
  • 1.2 试剂
  • 1.3 仪器设备
  • 1.4 培养基
  • 2 方法
  • 2.1 酵母的分离及纯化
  • 2.2 酵母的形态观察
  • 2.2.1 菌落形态观察
  • 2.2.2 细胞形态和培养特征
  • 2.2.3 酵母假菌丝的观察
  • 2.2.4 子囊孢子的显微镜观察
  • 2.3 生理生化测定
  • 2.3.1 碳源同化实验
  • 2.3.2 氮源同化实验
  • 2.3.3 类淀粉化合物的生成
  • 2.3.4 尿酶活性检测
  • 2.3.5 放线菌酮耐受检验
  • 2.3.6 高浓度D-葡萄糖的耐受实验
  • 2.3.7 耐盐度的测定
  • 2.4 酵母的分子遗传学鉴定
  • 2.4.1 基因组DNA 的提取
  • 2.4.2 DNA 样品浓度的测定及纯度检测
  • 2.4.3 PCR 反应中所用引物
  • 2.4.4 PCR 反应体系
  • 2.4.5 PCR 反应程序
  • 2.4.6 系统进化分析
  • 3 结果
  • 3.1 菌种的分离纯化
  • 3.2 酵母的形态观察
  • 3.3 生理生化测定结果
  • 3.3.1 碳氮源的同化结果
  • 3.3.2 生理生化检验
  • 3.4 酵母的分子遗传学鉴定
  • 3.4.1 基因组DNA 的提取结果
  • 3.4.2 26S rDNA D1/D2 区及 5.8S ITS 区 PCR 扩增结果
  • 3.4.3 系统发育分析
  • 4 菌株KK18 和KK20 的进一步鉴定
  • 5 菌株KK25 的色素提取及培养基的选择
  • 6 讨论
  • 第三章 一株分离自酸梅酱的酵母菌的分离鉴定
  • 引言
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 实验材料
  • 1.1.2 试剂
  • 1.1.3 仪器设备
  • 1.1.4 培养基
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 酵母的分离纯化
  • 1.2.2 酵母的形态学观察
  • 1.2.3 酵母的生理生化
  • 1.2.4 酵母的分子遗传鉴定
  • 2 结果
  • 2.1 酵母的形态学观察结果
  • 2.2 酵母的生理生化结果
  • 2.3 酵母的分子遗传鉴定结果
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的论文情况
  • 致谢
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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