狗肠新生物活性肽的分离纯化及结构测定

论文摘要

哺乳动物的胃肠道被认为是体内最大、最重要的内分泌器官。对其分泌的胃肠激素的研究已诞生了一门学科:胃肠内分泌学。随着蛋白质化学技术的发展,对胃肠激素的研究不断深入。大多胃肠激素在化学属性上属于多肽类,分子量大多在2kD～5kD范围,是热稳定性多肽。自1902年bayliss首先发现胰液素以来,已从中分离纯化出许多类型的胃肠肽,这些多肽根据其功能和一级结构的相似性大致可分为以下几个族:胰液素/胰高血糖素家族（最大的家族）; 胆囊收缩素/胃泌素家族; 胰多肽家族; 速激肽家族; 促生长激素抑制素/cortistatin家族; 阿片样物质; 胃泌素释放肽/蛙皮素家族; 肠和胰腺中的三叶肽; 抗菌肽家族。近些年来,有一些新的胃肠肽被分离,他们不具备这些已知肽的典型序列。这些肽以复杂的调节方式,对生命现象发挥重要的作用,与疾病密切相关。分离纯化天然存在的多肽是研究其结构、功能及物理、化学特性的首要步骤。本实验以狗肠作为研究对象,首先用沸水处理狗小肠,然后经醋酸提取、海藻酸吸附、盐酸洗脱、氯化钠盐析和乙醇沉淀,再经Sephadex G-25（fine）层析和两次RP-HPLC 分离,从中纯化出一个热稳定多肽。用Tris-Tricine-SDS-PAGE 鉴定其分子量约为4kD。该肽经胰酶水解,产物片断经RP-HPLC 分离后,取其中的一个主峰对应的肽段经CapLC-ESI-MS-MS （ Q-TOF2 ） 质谱仪测定氨基酸顺序为:T-E-Y-T-A-L-N-V-L-A-T-T-E-E-N-G。将该段氨基酸序列登录美国国立医学图书馆（NCBI）,应用Blast 检索工具进行短序列匹配的蛋白质数据库检索发现::此肽为首次发现的新多肽。经膜片钳实验初步检测,该肽能够增强胰腺β细胞膜的外向电流,对其完整的生理功能,尚待深入研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 胃肠肽研究概况
• 1.2 胃肠道内分泌细胞
• 1.3 胃肠肽的体内生物合成和酰氨化修饰
• 1.4 胃肠肽的功能和生理作用方式
• 1.5 脑肠肽
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与仪器
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂
• 2.3 常用溶液配制
• 3 方法
• 3.1 材料预处理及粗提
• 3.2 乙醇沉淀分离
• 3.3 Sephadex G-25 （fine）柱层析分离
• 3.4 反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化
• 3.5 Tris-Tricine-SDS-PAGE 电泳法鉴定分子量
• 3.6 多肽的水解和片断分离
• 3.7 序列测定和分析
• 4 结果
• 4.1 材料预处理及粗提
• 4.2 乙醇沉淀分离
• 4.3 Sephadex G-25（fine）分离
• 4.4 RP-HPLC 分离
• 4.5 活性肽分子量的鉴定
• 4.6 多肽的水解和片断分离
• 4.7 活性肽序列测定
• 4.8 膜片钳检测多肽功能
• 5 讨论
• 5.1 分离纯化方法的选择
• 5.2 电泳对小分子肽分子量的鉴定
• 5.3 多肽序列测定和分析
• 5.4 膜片钳检测多肽功能
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 附录2 质谱与蛋白质（肽）的序列结构测定
• 附录3 缩略词