鸭瘟病毒gC基因的发现、原核表达和应用研究

论文摘要

鸭瘟（Duck Plague,DP）,又称,鸭病毒性肠炎（Duck Enteritis）,是由α-疱疹病毒引起的鸭、鹅等雁行目动物的一种急性败血和高度接触性的传染病。相对其它疱疹病毒而言,DPV研究的总体水平较低,分子生物学所知甚少。本文对本实验室发现的鸭瘟病毒gC基因开展系列研究,获如下结果:1.鸭瘟病毒gC基因发现、克隆及分子特性分析对构建的鸭瘟病毒（DPV）DNA基因文库一个重组质粒测序,ORF Finder和BLASTN工具初步分析测序结果发现一个全长为1296bp的完整ORF片段（ORF1296）。大量生物信息学分析和斑点杂交证实该ORF与其它疱疹病毒gC基因同源,与禽疱疹病毒gC亲缘关系最近,为DPV的gC基因（GenBank登录号EU076811）。其大小为1296bp,编码432个氨基酸,编码的gC蛋白的理论分子量为45kD,理论等电点（PI）为5.292。推导的gC氨基酸序列的21～24,50～58,67～70,161～171,273～281,387～393位最有可能为抗原表位。2.鸭瘟病毒gC基因原核表达、产物纯化及其抗体制备根据发现的鸭瘟病毒的gC基因序列,设计一对引物扩增DPV gC基因并将其克隆至pMD18-T载体,经酶切和DNA测序鉴定正确后,将DPV gC基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的EcoRI和XhoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a-gC。将重组表达质粒pET32a-gC转化表达宿主菌BL21（DE3）,经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析表达出了大小约为65kD的目的重组蛋白。对pET32a-gC表达的融合蛋白Western blot免疫印迹分析发现,该蛋白能与DPV阳性血清发生特异性反应。大量提取pET32a-gC表达产物,纯化后免疫家兔成功制备兔抗DPV gC蛋白的多克隆抗体。3.鸭瘟病毒gC基因原核表达产物免疫原性研究将经纯化、复性的鸭瘟病毒gC基因原核表达蛋白与等量弗氏佐剂混合制备gC重组蛋白疫苗,免疫雏鸭研究对鸭的免疫保护效果。结果表明:重组蛋白可以诱导机体产生中和抗体,其中和效价和弱毒组变化一致,在免疫后21d达到最高。ELISA检测的血清抗体消长规律亦同弱毒组一致。DPV gC重组蛋白对鸭瘟病毒强毒感染具有一定的保护能力。4.抗gC蛋白抗体介导的免疫组化和免疫荧光检测DPV建立和应用以饱和硫酸铵沉淀法结合High Q阴离子交换柱层析纯化的兔抗DPV gC原核表达蛋白的IgG为一抗,分别建立检测石蜡切片上DPV的SP免疫组化法和间接免疫荧光双染法。应用建立的两种方法研究DPV-CHv强毒株人工感染雏鸭肝、肺、肾、脑、十二指肠、空肠、回肠、直肠、法式囊、脾脏、腺胃、食道等组织中DPV病毒定殖、动态变化规律和gC蛋白在各组织中表达时相。结果表明:DPV是一种泛嗜性的病毒,SP法和免疫荧光法均可特异检测到DPV感染鸭肝、肺、肾、脑、十二指肠、空肠、回肠、直肠、法式囊、脾脏、腺胃、食道中DPV抗原的存在。人工感染8h即可在十二指肠、空肠、回肠和直肠中检测到DPV gC的表达;攻毒12h时,肝、食道、腺胃可检测到病毒gC表达蛋白;24h可在法式囊、肾和脾脏可检测到gC表达蛋白;2d在肺、大脑检测到gC表达蛋白;3d到死亡鸭各组织器官均可持续检测到gC表达蛋白存在。5.抗gC蛋白抗体介导的抗原捕获ELISA检测DPV建立和应用以兔抗DPV gC基因原核表达蛋白为第一抗体,以纯化的兔抗DPV IgG为夹心抗体,建立并优化了检测DPV的抗原捕获ELISA方法。结果表明:gC重组蛋白的最佳包被浓度为1.6μg/孔,检测血清的最佳稀释度为1:80,酶标二抗的最佳稀释度是1:1000。本方法敏感、特异、稳定,可应用于临床病料DPV病毒的快速、批量诊断。6.DPV gC蛋白作为包被抗原检测鸭瘟抗体间接ELISA建立和应用以纯化的DPV gC表达蛋白作为包被抗原初步建立了检测鸭瘟抗体水平的间接ELISA法（gC-ELISA）,并对该方法进行了标准化研究。用本法（gC-ELISA）和本实验室研制DPV抗体检测试剂盒平行检测56份送检血清,符合率为94%,表明建立的gC ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性,可以用于DPV感染的诊断和疫苗免疫后的抗体监测。7.基于DPV gC基因的PCR检测方法建立和应用根据发现的DPV gC基因序列,建立检测DPV的PCR方法。特异性试验表明,设计引物对正常DEF细胞、鸭胚尿囊液及鸭肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒、小鹅瘟病毒、鸭巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌的核酸提取物进行的PCR的结果为阴性;而对DPV基因组DNA,其灵敏度可达到1pg;应用该PCR方法对DPV感染病料各组织进行检测,均能扩增出与预期大小一致的特异性条带。8.基于鸭瘟病毒gC基因建立的AC-ELISA、免疫组化、免疫荧光和PCR检测方法比较比较AC-ELISA、免疫组化、免疫荧光和PCR对DPV CHv强毒株感染鸭组织和临床病料检测结果的特异性、敏感性。结果发现,四种方法对鸭瘟阳性病料检测结果均为阳性,对正常鸭组织、鸭乙型肝炎病毒（DHBV）、鸭病毒性肝炎（DHV）、鹅细小病毒（GPV）、鸭疫里默氏杆菌（R.A.）、鸭源大肠杆菌（E.coli）、鸭源沙门氏菌（S.anatum）等病毒和细菌基因组的检测结果均为阴性。灵敏度试验显示:PCR方法灵敏度大于ELISA,ELISA的灵敏度大于SP免疫组化和间接免疫荧光。对临床鸭瘟病料检测显示四种方法检测结果基本一致,无显著性差异。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 疱疹病毒gC基因及其编码蛋白的研究进展
• 1 疱疹病毒的基因组及gC基因的结构和特性
• 2 疱疹病毒蛋白和gC蛋白的结构和特性
• 3 疱疹病毒gC与病毒的免疫及gC疫苗的研究
• 3.1 疱疹病毒gC与病毒的免疫
• 3.2 疱疹病毒gC疫苗的研究
• 第二章 鸭瘟检测技术的研究进展
• 1 临床诊断
• 2 实验室诊断
• 2.1 病毒的分离鉴定
• 2.2 血清学方法
• 2.3 分子生物学技术
• 3 小结
• 第二部分 试验研究
• 第三章 鸭瘟病毒gC基因发现、克隆及分子特性分析
• 1 材料
• 1.1 毒株和菌株
• 1.2 鸭胚
• 1.3 细胞培养试剂
• 1.4 T克隆相关试剂
• 1.5 斑点杂交试剂
• 1.6 主要仪器
• 1.7 主要试剂配制方法
• 2 方法
• 2.1 gC基因的发现
• 2.2 gC基因的扩增和克隆
• 2.3 DNA斑点杂交鉴定DPV gC基因
• 3 结果
• 3.1 gC基因的发现
• 3.2 gC基因的克隆和鉴定结果
• 3.3 gC基因的斑点杂交结果
• 3.4 gC生物信息学分析结果
• 4 讨论
• 4.1 关于斑点杂交
• 4.2 DPV gC基因的发现
• 4.3 DPV gC的二级结构和抗原表位预测
• 4.4 gC的功能和研究意义
• 5 小结
• 第四章 鸭瘟病毒gC基因原核表达、产物纯化及其抗体制备
• 1 材料
• 1.1 菌株/毒株/载体
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 引物的设计与合成
• 2.2 DPV gC基因的扩增
• 2.3 DPV gC基因的T克隆
• 2.4 原核表达重组质粒pET-32a-gC的构建
• 2.5 重组表达质粒的小量诱导表达
• 2.6 pET32a-gC重组蛋白的纯化
• 2.7 pET32a-gC表达产物的Western Blot检铡
• 2.8 兔抗DPV gC融合蛋白高免血清的制备及IgG的提取和纯化
• 3 结果
• 3.1 DPV基因的PCR扩增结果
• 3.2 pMD18-gC克隆鉴定结果
• 3.3 pMD18-gC的序列测定结果
• 3.4 表达重组质粒pET-32a-gC的鉴定结果
• 3.5 pET32a-gC的诱导表达结果
• 3.6 pET32a-gC表达蛋白在宿主菌中的分布结果
• 3.7 pET32a-gC表达蛋白纯化结果
• 3.8 pET32a-gC表达产物的活性检测结果
• 3.9 兔抗DPV gC融合蛋白高免血清的制备结果
• 4 讨论
• 4.1 DPV gC的表达载体的选择
• 4.2 重组蛋白的表达形式
• 4.3 疱疹病毒的gC蛋白的原核表达
• 4.4 兔抗gC重组蛋白IgG的制备和纯化
• 5 小结
• 第五章 鸭瘟病毒gC基因原核表达产物免疫原性研究
• 1 材料
• 1.1 菌株/毒株
• 1.2 试验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 gC表达蛋白免疫原的制备
• 2.2 试验动物分组与免疫
• 2.3 血清抗体检测试验
• 2.4 攻毒保护试验
• 3 结果
• 3.1 人工感染鸭不同时间血清ELISA抗体效价
• 3.2 鸭抗DPV gC血清中和抗体效价消长变化
• 3.3 攻毒保护试验结果
• 4 讨论
• 4.1 关于重组蛋白疫苗的研究
• 4.2 关于DPV gC重组蛋白免疫效力
• 5 小结
• 第六章 抗鸭瘟病毒gC基因原核表达蛋白抗体介导的免疫组化检测DPV的研究和应用
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 实验动物
• 1.3 抗体
• 1.4 仪器
• 1.5 试剂
• 1.6 主要试剂的配置
• 2 方法
• 2.1 DPV的增殖
• 2.2 兔抗鸭瘟病毒gC基因原核表达蛋白抗体的制备及其IgG提取
• 2.3 麻鸭的人工感染DPV实验
• 2.4 SP免疫组化染色方法的建立和优化
• 2.5 DPV全病毒抗体检测鸭瘟的间接酶免疫组化法（IP）的建立和应用
• 2.6 SP法检测DPV抗原于鸭体组织器官及细胞的定植分布规律
• 3 结果
• 3.1 SP酶免疫组化染色方法的建立和优化结果
• 3.2 间接酶免疫组化法和SP法的比较结果
• 3.3 SP法检测DPV抗原于鸭组织及细胞的定植分布规律的结果
• 4 讨论
• 4.1 SP免疫组化方法的建立和优化
• 4.2 SP法与DPV全病毒抗体检测鸭瘟的间接酶免疫组化法比较
• 4.3 SP法对DPV抗原的定位及DPV的分布规律
• 5 小结
• 第七章 抗鸭瘟病毒gC基因原核表达蛋白抗体介导的免疫荧光检测DPV的研究和应用
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 实验动物
• 1.3 抗体
• 1.4 仪器
• 1.5 试剂
• 2 方法
• 2.1 人工感染DPV鸭组织的采样、包埋及切片
• 2.2 间接免疫荧光检测DPV方法的建立与优化
• 3 结果
• 3.1 免疫荧光组化法建立和优化结果
• 3.2 检测DPV的定植和动态分布规律的结果
• 4 讨论
• 4.1 关于DPV gC的免疫荧光技术
• 4.2 关于荧光抗体技术
• 4.3 免疫荧光和免疫组化的比较
• 5 小结
• 第八章 免疫组化和荧光对gC在鸭瘟强毒感染雏鸭组织中的表达时相与定位研究
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 实验动物
• 1.3 抗体
• 1.4 仪器
• 1.5 试剂
• 2 方法
• 2.1 动物人工感染DPV及采样、组织包埋及切片
• 2.2 兔抗DPV高免血清的制备及其IgG纯化
• 2.3 基于gC蛋白SP法检测DPV方法的建立与优化
• 2.4 基于gC蛋白间接免疫荧光检测DPV方法的建立与优化
• 2.5 gC基因在鸭组织蛋白表达时相、侵染过程与定位分布
• 3 结果
• 3.1 gC基因在鸭组织蛋白表达时相、浸染过程与定位分布
• 4 讨论
• 4.1 关于疱疹病毒gC的表达和调控
• 4.2 关于DPV蛋白的表达时相
• 5 小结
• 第九章 抗鸭瘟病毒gC基因原核表达蛋白抗体介导的ELISA检测DPV抗原的研究和应用
• 1 材料
• 1.1 毒/菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 ELISA试剂的配制
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 兔抗DPV gC抗体的制备与纯化
• 2.2 样品的处理
• 2.3 抗DPV gC蛋白抗体介导的抗原捕获ELISA方法的建立
• 2.4 抗DPV gC蛋白抗体介导的抗原捕获ELISA方法的应用
• 3 结果
• 3.1 抗原捕获ELISA检测DPV方法的建立与优化结果
• 3.2 AC-ELISA检测DPV方法的应用
• 4 讨论
• 4.1 关于DPV的检测
• 4.2 关于ELISA的建立
• 5 小结
• 第十章 鸭瘟病毒gC基因原核表达蛋白作为包备抗原ELISA检测DPV抗体的研究和应用
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 血清
• 1.3 主要试剂
• 1.4 ELISA试剂的配制
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 DPV gC基因原核表达蛋白的获得与纯化
• 2.2 DPV gC基因原核表达蛋白作为包被抗原间接ELISA方法的建立
• 2.3 间接ELISA方法检测DPV抗体的应用
• 3 结果
• 3.1 DPV gC表达蛋白间接ELISA方法的建立
• 3.2 临床血清的检测结果
• 4 讨论
• 4.1 关于疱疹病毒的gC蛋白
• 4.2 关于gC-ELISA的建立
• 5 小结
• 第十一章 检测DPV gC基因PCR方法的建立与应用
• 1.材料
• 1.1 毒/菌株
• 1.2 组织病料
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2.方法
• 2.1 PCR引物
• 2.2 毒/菌株DNA模板的提取
• 2.3 PCR反应体系的建立
• 2.4 PCR灵敏性检验
• 2.5 PCR特异性检验
• 2.6 感染病料的检测
• 3 结果
• 3.1 gC基因引物对DPV强、弱毒DNA的检测结果
• 3.2 PCR灵敏性试验结果
• 3.3 PCR特异性试验结果
• 3.4 感染病料的检测结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第十二章 基于鸭瘟病毒gC基因的ELISA、免疫组化、免疫荧光和PCR检测方法的比较
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 组织病料
• 2 方法
• 2.1 基于鸭瘟病毒gC基因检测方法的建立
• 2.2 组织病料的检测
• 3 结果
• 3.1 基于DPV gC基因四种检测方法的特异性
• 3.2 四种检测方法对DPV攻毒组织检测比较结果
• 3.3 建立基于gC基因检测方法对临床鸭瘟病料检测结果
• 4 讨论
• 4.1 基于gC基因检测方法的敏感性
• 4.2 检测DPV病原方法的比较
• 4.3 基于gC基因检测方法的比较
• 5 小结
• 第三部分 结论
• 第四部分 参考文献
• 第五部分 致谢
• 第六部分 附图
• 第六章 附图
• 第七章 附图
• 第八章 附图