桃儿七种子休眠特性及其种胚组织培养研究

论文摘要

桃儿七（Podophyllum hexandrum Royle）是小檗科桃儿七属多年生草本植物,其根茎中含有大量的木脂素类物质,其中鬼臼毒素（Podophyllotoxin）抗癌以及抗艾滋病等活性最高,是合成VP16（Etoposide）、VM26（Teniposide）等药物的起始物质。由于药用市场对鬼臼毒素需求的逐渐增加以及对桃儿七药用资源的过度开发与利用,导致桃儿七资源已面临匮乏与濒危,早在1992年已被列入《中国珍稀濒危植物名录》,并被《中国植物红皮书》收录。另外,桃儿七具有生长周期长（自然条件下需5-7年）、种子萌发不良等生理特性,也是导致其濒危的重要原因之一。所以,利用桃儿七细胞组织培养进行鬼臼毒素的工厂化生产是一条切实可行的途径。但是,由于桃儿七分布区域小,对生长环境要求高,这一特性使得其在细胞组织培养过程中存在分化难度大、生长缓慢等难题,导致桃儿七细胞组织培养的研究进展尤为缓慢。本论文以桃儿七种子休眠研究为前提,解决了桃儿七组织培养过程中外植体分化难度大、易褐化等问题,并以此基础上建立了利用桃儿七种胚组织培养体系及鬼臼毒素的CO2-SFE提取与检测技术,为桃儿七这一濒危珍稀资源的保护利用与鬼臼毒素的工业化生产提供了重要的理论依据。其具体内容如下:1.利用GA3浸种、低温层积等方法对桃儿七种子休眠生理进行研究。结果表明:种皮和胚乳的限制以及生理后熟可能是是引起桃儿七种子休眠的主要原因,用400mg/L的GA3浸种24 h或低温层积后用GA3处理均能在一定程度上解除休眠、促进萌发,其中以低温层积90d后再用500mg/L的GA3浸种36h效果最好,发芽率和发芽势分别达到81.11%和50.00%。2.用水、甲醇和乙醚分别对种子进行浸提,浸提液生物抑制活性依次为乙醚>甲醇>水。乙醚浸提液经气质联用仪（GC-MS）分离和鉴定出脂肪酸、醇类、烯类等19种有机化合物,其中多数已被证明具有生物抑制活性。对苯二酚是首次从桃儿七种子中分离出来的生物活性物质,其生物活性鉴定结果表明:高浓度的对苯二酚具有较强的生物抑制活性,而低浓度的对苯二酚则相反,在浓度为1×10-1 mg/L时,可显著促进小麦的生长和发育,相对于对照提高148.92%;在比较对苯二酚与其它植物激素（NAA、IAA、GA3、6-BA）的生物活性后发现,对苯二酚具有类似于植物激素的刺激作用。3.通过采用不同种类的培养基（1/2MS、MS、B5、MB、IMS）、碳源、不同琼脂浓度、外源激素及光温等措施,对桃儿七种子成熟胚进行无菌苗和愈伤组织诱导研究,综合结果表明:以MS为基本培养基,添加0.3mg/L GA3可获得生长良好的无菌苗,诱导率达87.25%;添加1.0mg/L 2,4-D + 0.4mg/L KT + 0.3mg/L GA3的激素配比,愈伤组织诱导率可达36.67%;培养温度及光照时间分别为22℃和24 h全日光照时最有利于无菌苗和愈伤组织的诱导,并有效降低褐化率。无菌苗培养65天后,对其进行鬼臼毒素的CO2-SFE萃取与含量的检测,其根及茎叶中有鬼臼毒素的存在,干重含量分别达34.5337μg/g、9.6088μg/g。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩写词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 桃儿七及其鬼臼毒的素研究
• 1 桃儿七生物学特性
• 1.1 地理分布
• 1.2 形态特性
• 1.3 植物化学
• 1.4 药理的发现及应用
• 2 鬼臼毒素及其衍生物
• 2.1 鬼臼毒素及其衍生物的分子结构
• 2.2 鬼臼毒素及其派生物的药理作用
• 2.3 鬼臼毒素及其衍生物对的药物学机理
• 3 鬼臼毒素的获取途径
• 3.1 化学合成
• 3.2 生物合成
• 3.3 细胞培养
• 3.4 组织器官培养
• 3.5 转基因发根农杆菌
• 3.6 生物反应器
• 3.7 天然植物中提取
• 第二节 种子休眠类型及打破休眠方法概述
• 1 种子休眠的分类
• 2 种子休眠原因
• 2.1 内源性休眠
• 2.2 外源性休眠
• 2.3 综合性休眠
• 3 种子休眠机理
• 3.1 透性机理
• 3.2 抑制剂作用机理
• 3.3 氧化途径学说
• 3.4 激素调节学说
• 3.5 光敏素学说
• 3.6 基因表达的调节学说
• 3.7 其它学说
• 4 种子休眠解除方法
• 4.1 层积处理
• 4.2 酸蚀处理
• 4.3 激素处理及机理
• 4.4 化学药剂处理
• 4.5 分子生物学机理
• 2 作用机理'>4.6 CO₂作用机理
• 第二章 论文设计
• 1 实验设计
• 2 本研究的创新点
• 3和低温层积处理在解除桃儿七种子休眠中的应用'>第一部分 GA₃和低温层积处理在解除桃儿七种子休眠中的应用
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 种子吸水性能的测定
• 1.2.2 种子生活力测定及分离胚培养
• 1.2.3 生物鉴定
• 3 浸种处理'>1.2.4 GA₃浸种处理
• 3 综合处理'>1.2.5 低温层积和 GA₃综合处理
• 1.2.6 发芽测定与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 种子的形态结构
• 2.2 种子的吸水性能
• 2.3 种子的分离胚培养
• 2.4 种子浸提液对小麦和黄瓜萌发和生长的影响
• 3 处理对种子萌发的影响'>2.5 不同浓度 GA₃处理对种子萌发的影响
• 3 处理对桃儿七种子萌发的影响'>2.6 不同低温层积和400 mg/L GA₃处理对桃儿七种子萌发的影响
• 3 及浸种时间对桃儿七种子萌发的影响'>2.7 低温层积90d 后不同浓度 GA₃及浸种时间对桃儿七种子萌发的影响
• 3 讨论
• 第二部分 桃儿七种子中生物活性物质的GC-MS 分离及鉴定
• 1 方法
• 1.1 不同提取液对种子生物活性物质的提取与鉴定
• 1.2 乙醚对种子生物活性物质的提取
• 1.3 乙醚提取物的 GC-MS 分离与鉴定
• 1.4 生物活性物质的鉴定
• 2 结果
• 2.1 不同提取液的生物活性鉴定
• 2.2 乙醚提取物的GC-MS分离结果
• 2.3 对苯二酚的生物活性鉴定
• 2.4 对苯二酚与其它植物激素的生物活性比较
• 3 讨论
• 第三部分 桃儿七种胚的组织培养及鬼臼毒素的提取检测
• 1 方法
• 1.1 种子处理
• 1.2 诱导结果统计
• 2-SFE 萃取与检测'>1.3 鬼臼毒素的 CO₂-SFE 萃取与检测
• 2 结果
• 2.1 无菌苗的诱导
• 2.1.1 不同浓度琼脂对胚生长的影响
• 2.1.2 不同碳源对胚生长的影响
• 2.1.3 不同外源激素对胚生长的影响
• 2.1.4 不同培养基对胚生长的影响
• 2.1.5 光照和温度对胚生长的影响
• 2.2 愈伤组织诱导
• 2.3 不同附加物对种胚愈伤组织诱导的影响
• 2.4 组织培养与自然条件下鬼臼毒素的含量比较
• 3 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附件1 自然条件下生长的桃儿七
• 附件2 桃儿七的无菌苗
• 附件3 桃儿七的愈伤组织与对苯二酚与其它植物激素的生物活性比较
• 附件4 对苯二酚与其它植物激素对小麦的生物活性比较
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