水稻中与harpinXo互作的蛋白OsHIP26的研究

论文摘要

OsHIP26是本实验室前期研究中利用酵母双杂交技术从日本晴水稻cDNA文库中得到的能与水稻黄单胞的harpinXoc （hpalXoc,也简写为hrf2或h2）互作的一个cDNA片段,序列全长528bp。经过序列blast后发现在水稻、玉米以及毛竹中都存在着OsHIP26的同源序列。为了进一步确证OsHIP26和]harpinXoc（?）目互作用,以及两个作用蛋白中的关键功能域,我们通过设计不同的缺失片段,将其克隆到相应的酵母双杂交载体上,构建成重组载体,转化酵母菌株后把重组载体转入对应的酵母菌中后利用酵母双杂交技术来检测不同片段间的的互作。结果显示,对于OsHIP26,246bp-266bp为互作的关键区域,缺少这部分的亚克隆都无法与harpinXoc发生互作。来自稻黄单胞菌的harpinXoo （hpalXoo,也简写为hrf1或h1）和]harpinXoc一样都可以和OsHIP26互作。对hrf1的五个缺失片段的研究发现,只有位于hrf1的277-420bp的缺失片段C能与OsHIP26互作。该片段中可能存在一个与OsHIP26互作的活性中心。使hrfl失去过敏反应的hrf1L51P突变体经酵母双杂交显示存在有自激活活性,这说明,51位氨基酸由L（亮氨酸）改变为P（脯氨酸）,可能改变了蛋白的高级结构或构象,从而使突变体改变了原功能。这一点和实验室前人得到的结果一致。为研究OsHIP26的亚细胞定位,选取可以和hrfl互作的Y5片段（1-267bp）,构建GFP融合植物表达重组体。通过农杆菌侵染法,感染洋葱的表皮细胞,在荧光显微镜下观察GFP的表达情况,结合细胞的质壁分离,结果显示在洋葱表皮的细胞壁和细胞核中荧光比较强烈,细胞质中也有荧光,但相对较弱。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 植物病原菌hrp基因和Harpin蛋白
• 1.1 hrp基因的发现和分布分类
• 1.2 Harpin蛋白的发现
• 1.3 Harpin蛋白的生理生化特性
• 1.4 Harpin蛋白的生物活性
• 1.5 Harpin在植物中的作用位点及受体的研究
• 1.6 展望
• 第二章 蛋白互作检测技术
• 1 酵母双杂交技术
• 1.1 经典酵母双杂交的建立及其原理
• 1.2 经典酵母双杂交的优点
• 1.3 经典酵母双杂交系统的缺陷和解决办法
• 1.4 酵母双杂交系统的发展衍生
• 1.5 酵母双杂交系统的应用和前景
• 2 免疫共沉淀
• 3 细菌双杂交系统
• 4 生物信息学
• 5 本文的研究背景和意义
• 下篇 研究内容
• 第一章 与harpin互作的OsHIP 26功能域的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂,培养基,载体及菌株
• 1.1.1 培养基
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 菌株和载体
• 1.2 OsHIP 26各缺失片段的获得及扩增
• 1.2.1 亚克隆目的片段的『增
• 1.2.2 目的片段与载体的连接
• 1.2.3 大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.4 连接产物的转化
• 1.2.5 转化子的鉴定
• 1.2.6 质粒提取
• 1.3 酵母双杂交
• 1.3.1 酵母感受态的制备
• 1.3.2 酵母转化
• 1.3.3 酵母接合实验
• 1.3.4 自激活实验
• 2 结果和分析
• 2.1 含有OsHIP 26结构域不同缺失片段重组载体构建
• 2.2 OsHIP 26各末端缺失片段表达蛋白和hrf2的互作检测
• 2.3 Y10自激活实验
• 3 讨论
• （1-267）与harpinXoc的互作Western blot验证'>第二章 OsHIP 26_（1-267）与harpinXoc的互作Western blot验证
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 试剂,培养基,载体及菌株
• 1.1.1 大肠杆菌及相关培养基同第一章1.1.1
• 1.1.2 限制性内切酶及试剂盒
• 1.1.3 载体和菌株
• 1.1.4 缓冲液及试剂配方
• 1.2 GST重组载体的构建
• 1.2.1 目的片段的扩增
• 1.2.2 目的片段与载体的连接
• 1.2.3 连接产物的转化
• 1.2.4 转化子的鉴定
• 1.3 GST融合蛋白的原核表达和纯化
• 1.3.1 融合蛋白提取
• 1.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳
• 1.3.4 蛋白浓度的测定
• 1.3.5 GST融合蛋白纯化
• 1.4 Western blot检测
• 2 结果和分析
• 2.1 GST融合重组载体的构建
• 2.1.1 引物设计
• 2.1.2 重组载体克隆子的获得与鉴定
• 2.2 GST融合蛋白的原核表达和纯化
• （1-267）和hrf2蛋白互作的Western blot检测'>2.3 OsHIP 26_（1-267）和hrf2蛋白互作的Western blot检测
• 3 讨论
• （1-267）的亚细胞定位'>第三章 OsHIP 26_（1-267）的亚细胞定位
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂及培养基
• 1.2 荧光载体的构建
• 1.2.1 目的片段的获得及扩增
• 1.2.2 目的片段与载体的连接
• 1.2.3 连接产物的转化
• 1.2.4 质粒提取
• 1.3 农杆菌的转化
• 1.3.1 农杆菌感受态的制备
• 1.3.2 农杆菌转化
• 1.3.3 农杆菌转化子的验证
• 1.4 洋葱表皮荧光定位
• 2 结果和分析
• 2.1 亚细胞定位载体构建
• 2.2 农杆菌转化
• 2.3 洋葱表皮亚细胞定位
• 3 讨论
• 第四章 hrf1中与OsHIP 26作的关键结构域的研究
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 试剂与培养基
• 1.2 含有hrf1各缺失片段的重组载体构建
• 1.2.1 hrf1各缺失片段的的扩增
• 1.2.2 目的片段与载体的连接
• 1.2.3 连接产物的转化
• 1.2.4 转化子的鉴定
• 1.2.5 质粒提取
• 1.3 酵母转化
• 1.3.1 酵母感受态的制备
• 1.3.2 酵母转化
• 1.3.3 酵母接合实验
• 1.4 h1缺失片段的自激活实验
• 1.5 Y10与h1缺失片段的互作
• 1.6 h1缺失片段突变体的研究
• 2 结果
• 2.1 含有hrf1各缺失片段的重组载体构建
• 2.2 h1及其缺失片段同OsHIP 26接合检测结果
• 2.3 自激活实验
• 2.4 Y10和hrf1缺失片段的互作检测
• 2.5 hrf1点突变体A（L51P）,D（L51P）,D（F88S）和OsHIP 26作的研究
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 全文名称及缩写词
• 致谢