一个新的酪氨酸激酶受体RON的剪接变异体的生物学特征及其功能的初步研究

论文摘要

酪氨酸激酶受体RON的变异体在结直肠肿瘤的转移过程中发挥了重要作用,到目前为止已有6个和肿瘤相关的RON的变异体被发现,其中4个能促进肿瘤转移,已经有近6年没有具有促肿瘤转移功能的RON变异体被发现。在我们最近的研究中我们在结肠癌肝转移灶中发现了一个新的变异体,由于RT-PCR及测序结果发现缺失了外显子2和3,共计318个碱基,也就是缺少了106个氨基酸,因此我们将其命名为RON106,其生物学特征及功能尚不明确。目的：探讨新变异体的分子量大小、表达部位等生物学特征,以及对细胞移动/浸润能力的初步研究。方法：首先用RT-PCR方法检测在常见的结直肠癌以及胃癌细胞株中外显子2、3的缺失情况；用免疫沉淀以及Western Blot免疫印迹的方法测定在HCT-116细胞中该变异体的分子量大小；以PCR克隆的方法构建含RON106的质粒,并转染至上皮细胞HEK-293细胞中建立稳定表达的细胞系；以免疫沉淀和Western Blot证实RON106受体在HEK-293细胞中表达的分子量大小,并判断其α、β链及pro-RON106的存在情况；采用细胞表面标记的方法判断在缺失外显子2和3后RON106是否仍在细胞膜上表达；以免疫沉淀以及Western Blot免疫印迹的方法检测RON106的自磷酸化情况以及在配体MSP刺激后的磷酸化情况；以细胞迁移实验以及划痕实验测定293RON106细胞移动能力的改变。结果：在多个结直肠癌以及胃癌的细胞系中发现存在RON的外显子2和3的缺失；在HCT-116中发现RON106蛋白的表达,免疫沉淀以及Western Blot检测发现其分子量约160Kd；我们通过PCR克隆的方法建立pcDNA3.1（RON106）的质粒,并转染入HEK293细胞建立稳定转染的细胞系一293RON106；通过免疫沉淀以及Western Blot检测同样证实其分子量约160Kd,但不论是否有MSP的刺激,RON106均不产生酪氨酸的磷酸化；通过检测其下游通路发现,RON106能自主激活AKT但不能激活p-erk1/2, AKT在293RON106细胞中的激活与MSP的刺激无关,可能由于与PI3-K的p85亚单位直接结合从而引起下游通路的激活；同时该蛋白仅有pro-ARON存在,在自然状态下其α、β链不发生分离,缺乏成熟的RON106α、β链,而且通过细胞表面标记发现该蛋白质仅在细胞内表达,不在细胞膜上表达,但在还原剂2-巯基乙醇的作用下可部分形成成熟的β链和α链；通过细胞迁移实验以及划痕实验发现相对于空载对照细胞以及293wtRON细胞在没有MSP刺激的情况下,293RON106细胞的移动能力增强,但RON的配体MSP并不能增强其移动能力。而且PI3-K的抑制剂LY294002能抑制RON106引起的细胞移动,但MAPK的抑制剂PD98059不能抑制其移动。结论：我们新发现的变异体RON106其分子量大小约160Kd,在多个结直肠癌及胃癌细胞系中可发现RON106的存在。在稳定转染的细胞系293RON106中,RON106在细胞浆内表达,并以pro-ΔRON的形式存在。不论有无MSP的刺激其酪氨酸区域均不发生磷酸化,但能引起其下游的AKT激活。RON106的存在可使上皮细胞的移动能力增强。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器及设备
• 2.2 材料及试剂
• 2.3 溶液配置
• 2.4 实验方法
• 2.5 技术线路
• 3 结果
• 3.1 在结肠癌肝转移灶中发现有新的缺失片段存在,经测序发现缺失了外显子2 和3
• 3.2 PCR检测发现在多个肿瘤细胞株中存在外显子2和3的缺失
• 3.3 新的剪接变异体在结肠癌细胞株中的表达,判断其分子量大小
• 3.4 质粒pcDNA4HisMaxC（RON106）的构建
• 3.5 在HEK293细胞中转染RON106,检测RON106的分子量大小、磷酸化状态以及可能的信号传导通路
• 3.6 RON106蛋白在细胞浆内表达
• 3.7 RON106促进细胞移动
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 本研究创新之处
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果