枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

论文摘要

纤维素酶是一组复合酶的统称，主要包括内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，这三种酶协同作用将纤维素转化成葡萄糖。近年来随着纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。然而，纤维素酶的大规模工业化应用在很大程度上受酶活较低以及成本较高的限制。通过基因工程手段，提高纤维素酶的活性是降低纤维素酶成本的一个有效途径。本研究以枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因为目的基因（GenBank Accession No．DQ782954），设计上游引物（引入KpnⅠ酶切位点），在终止密码子处设计下游引物（引入EcoRⅠ酶切位点），用高保真度的DNA聚合酶进行PCR扩增，得到大小约1.5Kb的单一条带产物，即为目的内切葡聚糖酶基因片段。该产物经KpnⅠ和EcoRⅠ酶切处理后连接到大肠杆菌表达载体pET-32a的多克隆位点上，并转入大肠杆菌BL21（DE3）中。在含有100μg／mL的Amp抗性LB平板上筛选后，经酶切鉴定，获得重组转化子，命名为pET-C36。采用刚果红染色法检测选择性LB平板（含有Amp、CMC-Na、IPTG）上的转化子，发现菌落周围有透明水解圈，表明重组转化子具有内切葡聚糖酶活性。用含Amp（100μg/mL）抗性的LB培养基对重组转化子进行培养，并加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养4～6h，测定酶活力达99.02U／mL。SDS-PAGE电泳结果表明重组酶相对分子量为73KD。进而研究了诱导温度、培养时间、IPTG诱导浓度和乳糖诱导浓度对内切葡聚糖酶基因表达的影响，结果表明此基因工程菌的最适培养条件为：最适诱导温度43℃，最适诱导培养时间5h，IPTG诱导终浓度0.1mmol／L或乳糖诱导终浓度0.1％，在此条件下诱导培养后酶活力可达141.22U／mL，是原始菌株C-36（79.2U／mL）的1.78倍。酶学性质研究表明：该酶的最适反应温度为65℃，最适pH值为pH6.0，在30℃～75℃及pH4.5～pH10.0处理后残余酶活力可保持最高酶活的70％以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 纤维素的分子结构及大小
• 1.2 产纤维素酶的微生物
• 1.3 纤维素酶的组成和功能
• 1.4 纤维素酶的多型性
• 1.5 纤维素酶基因的克隆与表达
• 2 研究目的及意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 实验仪器
• 3.1.5 抗生素贮存液
• 3.1.6 琼脂糖电泳试剂
• 3.1.7 SDS-PAGE电泳试剂
• 3.1.8 刚果红染色液
• 3.1.9 纤维素酶活力测定溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 内切葡聚糖酶基因表达片段的扩增
• 3.2.2 重组表达载体的构建
• 3.2.3 重组菌株pET-C36在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.2.4 诱导温度对产酶的影响
• 3.2.5 培养时间对产酶的影响
• 3.2.6 IPTG浓度对产酶的影响
• 3.2.7 乳糖浓度对产酶的影响
• 3.2.8 内切葡聚糖酶最适反应pH的测定
• 3.2.9 内切葡聚糖酶pH稳定性的测定
• 3.2.10 内切葡聚糖酶最适反应温度的测定
• 3.2.11 内切葡聚糖酶热稳定性的测定
• 4 结果与分析
• 4.1 内切葡聚糖酶基因表达片段的扩增
• 4.2 重组表达载体的构建
• 4.3 重组菌株pET-C36在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.4 重组菌株的SDS-PAGE分析
• 4.5 诱导温度对产酶的影响
• 4.6 培养时间对产酶的影响
• 4.7 IPTG浓度对产酶的影响
• 4.8 乳糖浓度对产酶的影响
• 4.9 内切葡聚糖酶的最适反应pH
• 4.10 内切葡聚糖酶的pH稳定性
• 4.11 内切葡聚糖酶的最适反应温度
• 4.12 内切葡聚糖酶热稳定性
• 5 讨论
• 5.1 表达系统的选择
• 5.2 影响大肠杆菌表达的因素
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间参与发表的文章