论文摘要
高效液相色谱法（High performance liquid chromatography, HPLC）在医药领域有着极其广泛的应用,其定性定量的准确性,对于药物研发、质量控制、指纹图谱等方面的工作有着极其重要的意义。然而,HPLC分析中的金属螯合效应可造成峰形严重拖尾,甚至形成新的杂峰,改变色谱峰形、积分面积,干扰其重现性,进而降低图谱的定性定量的准确度和可信度。已有报道从概念和基本现象上阐述HPLC中的金属螯合效应,但未见金属量与色谱峰形间的量效关系研究。本文力图从简单的模式化合物入手,以向样品溶液中定量添加金属离子的方式模拟样品在分析前和进入色谱柱时接触金属离子后发生反应,通过设计一系列色谱学实验考察由此产生的色谱行为变化。建立了以峰对称度为指标考察峰形变化的量化评价方法,旨在考察HPLC体系中金属离子的存在对色谱峰的影响程度、可能环境等问题,进而探索可能的预防和纠正办法,为提高HPLC应用水平提供重要参考。本研究选择柠檬酸和2,2’-联吡啶作为模式化合物,因柠檬酸结构简单、螯合位点明确,且是植物药物中常见的有机酸,具有代表性;而2,2’-联吡啶能够象征性地说明化合物在碱性条件下受金属离子影响的情形,且能与结构相似但没有螯合性的4,4’-联吡啶平行进样,便于比较。主要研究内容为:（1）根据实际经验而运用序贯优化法,建立样品的最佳色谱分析条件;（2）构建以色谱峰对称度为主要指标的评价方式,量化评价柠檬酸和2,2’-联吡啶样品溶液中定量添加不同种类和数量的金属离子后色谱峰的变化情况,并绘制变化趋势图;（3）变更流动相pH值后进行考察:在酸性流动相下,柠檬酸样品中混入不同种类和数量的金属离子后进行分析;在碱性流动相下,2,2’-联吡啶样品中混入不同种类和数量的金属离子后进样分析;4,4’-联吡啶样品相同处理后平行进样,以作对照;（4）探讨EDTA（取其二钠盐形式,下同）加入到样品溶液中和作为流动相使用时,对于待测样品的保护作用。通过实验,得到以下结论:（1）金属离子对螯合性化合物的HPLC分析的影响①对于具有螯合性质的样品,金属离子能够对样品的色谱峰形产生显著的影响,造成峰的对称度显著变化,按偏离1.0的方向升高或降低（即拖尾）,乃至产生一至若干个杂峰,且金属离子的影响效应随其在溶液中所占比例增大而增加;样品溶液中存在部分有机溶剂对样品与金属离子的相互作用基本没有影响;②化合物与金属的螯合活性和反应速率不同,有可能对图谱的重现性造成影响。在柠檬酸样品与金属离子接触的至少一小时内,体系处于不稳定状态,螯合反应的发生及反应程度难以预计,且能产生不可重现的杂峰,24h后溶液体系基本稳定,图谱能够再现并显示出一定的规律性;而与金属离子混合后的2,2’-联吡啶溶液,初次进样即出现明显的规律性,24h和48h后重复进样,再现性良好,表明2,2’-联吡啶与金属离子间反应迅速且产物稳定。③由于与化合物的螯合活性及螯合产物稳定性的不同,不同种金属离子的影响效应间存在差异,对柠檬酸为:FeⅢ>FeⅡ>AlⅢ>ZnⅡ≈CaⅡ;对于2,2’-联吡啶则是:pH7.0流动相下FeⅡ>FeⅢ>AlⅢ>CaⅡ>ZnⅡ;pH8.0流动相下FeⅡ>FeⅢ>CaⅡ>ZnⅡ>AlⅢ。④流动相的pH值可显著改变待测样品与金属离子间的相互作用程度。酸性流动相条件能够抑制柠檬酸与金属离子的螯合效应,在pH2.0流动相下,各金属离子对峰形的影响均被减弱;碱性流动相条件能够提高2,2’-联吡啶与金属离子的反应程度,在pH9.0流动相下,少量金属离子即可对峰形产生严重干扰。这与化学中酸性环境抑制螯合反应,碱性环境促进螯合反应的结论是一致的。（2）EDTA作为保护试剂的效果①EDTA加入柠檬酸溶液不能有效避免样品与金属离子的相互作用,反而使样品分析复杂化;加入2,2’-联吡啶溶液中,则能够较好地保护待测样品,使色谱峰形在相当程度上保持稳定。②以EDTA溶液作为水相,与甲醇组成流动相分析柠檬酸,出现宽峰、峰高大幅降低、基线抬升等现象,不能取得预期效果。分析认为这与EDTA和柠檬酸在水溶液中同为有机酸阴离子,结构上有相似性有关。而将其用于分析2,2’-联吡啶,从结果看色谱峰形良好、对称度保持相对稳定,受金属离子的影响大大减小。③结合变化幅度和图谱表现而言,以EDTA溶液作为流动相用于螯合性物质的色谱分离,效果优于将EDTA加入样品溶液。④综上,EDTA作为HPLC分析中的螯合保护剂并非对所有样品都有效,有时反而得不偿失,必须根据具体情况采用。