论文摘要
研究目的正己烷（n-hexane）是一种常用的工业溶剂,主要应用于粘胶配制、除污、干洗、植物油提取、制鞋、印刷、油漆、制药、家具制造及电子元件制造等行业。由于正己烷的急性毒性较低,而使人们忽视了长期慢性低浓度接触正己烷可导致以感觉运动型多发性周围神经病为主要临床特征的慢性中毒。正己烷中毒患者早期表现为手足发麻、刺痛、蚁走感、手足部痛觉、触觉减退呈手套、袜套样分布等,进一步发展可表现为四肢无力、行走困难以至不能站立甚至出现下肢瘫痪及肌肉萎缩。神经病理检查发现损伤最初发生在远端最长、最粗的感觉和运动神经轴索,并且在郎飞氏节附近形成巨大的充满神经丝（neruofilament,NFs）的肿胀,郎飞氏节解剖结构扭曲且髓鞘从肿胀处回缩,有时伴有节段性脱髓鞘,最后一些远离神经肿胀部位的轴索发生变性。尽管许多工作致力于正己烷中毒性神经病的研究,但其发病机制尚不清楚。基于正己烷中毒的超微结构观察和组织病理学改变,为进一步探讨正己烷中毒性神经病发生的分子机制,我们建立了正己烷终毒物2,5-己二酮（2,5-hexanedione,HD）亚慢性中毒大鼠模型,以细胞骨架蛋白为切入点,观察中毒性神经病发生过程中NFs、微管（α-tubulin、β-tubulin）和微丝（β-actin）蛋白相对含量的变化,确定作用靶点,并在此基础上从细胞骨架蛋白降解的角度进一步探讨细胞骨架蛋白变化的原因,包括磷酸化及其相应蛋白激酶信号通路的变化、泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）的改变等等,为正己烷职业中毒的预防和治疗提供可以借鉴的基础资料。同时,探讨血清中各骨架蛋白含量的变化评价正己烷接触的效应标志物以检测和评价神经系统损伤的可行性,为正己烷等毒物神经毒性的临床监测提供实验依据。研究方法1.雄性Wistar大鼠用200和400 mg/kg.bw的HD腹腔注射染毒,染毒时间8周（每周染毒5d,每日1次）,建立正己烷中毒性周围神经病模型。2.取大鼠大脑、脊髓和坐骨神经组织在匀浆缓冲液(1%Triton X-100,50 mM Tris（pH 7.5）,25 mM KCl,2 mM MgCl2,5 mM EGTA,5 mM dithiothreitol,ProteaseInhibitor Cocktail（50ul╱g tissue）and phosphatase inhibitors（5 mM Na3VO4,10mM Na4P2O7 and 1 mM iodoacetic acid）中制备匀浆,100,000×g、4℃离心60 min。采用Western-Blotting技术研究大鼠大脑、脊髓、坐骨神经上清和沉淀以及血清中phos-NF-H（pNF-H）、phos-&n-phos-NF-H（p&n-pNF-H）、NF-M、NF-L、α-tubulin、β-tubulin和β-actin等骨架蛋白。3.神经组织通过匀浆缓冲液A（20 mM Tris-HCL buffer（PH 7.4）,1 mM DTT,5mM EGTA,2 mM EDTA,10%glycerol,1 mM MgCl2,1 mM PMSF,2μg/mlaprotinin,and 2μg/ml leupeptin）和B（100 mM KCl,5 mM NaCl,3 mM MgCl2,50 mM Hepes,pH 7.4,1 mM dithiothreitol（DTT）,0.5μg/ml aprotinin,0.5μg/mlleupeptin,200μM PMSF and 1 mM EGTA）制备组织匀浆,然后27,000×g、4℃离心60 min提取神经组织胞膜和胞浆蛋白组分,分别测定钙调蛋白（calmodulin,CaM）、钙调蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/CaM-dependent protein kinaseⅡ,CaMKII)、蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）、蛋白激酶C蛋白激酶C（proteinkinase C,PKC）、周期蛋白依赖性的蛋白激酶5（cyclin dependent kinase 5,CDK5）和CDK5相关因子含量的变化。4.取大鼠大脑、脊髓和坐骨神经组织胞膜和/或胞浆蛋白组分,利用放射性同位素技术研究HD染毒对大鼠神经组织中CaMKII、PKA、PKC和CDK5活性的影响。5.真核表达Flag-NFM质粒的构建、转化、鉴定、扩增和提纯。6.培养HEK293细胞,将不同质粒按不同目的需要组合,利用细胞转染技术转染HEK293细胞,采用免疫共沉淀和Western-blotting等技术检测HD染毒情况下NFs与E3连接酶的结合、泛素化以及被蛋白酶体降解情况。7.神经组织在相应匀浆液（50 mM Tris HCl,pH 7.4,150 mM NaCl,1 mM EDTA,1%Triton X-100 and 1%Protease Inhibitor Cocktail）中8200×g、4℃离心30min,取上清,测定UPS系统中各组分E1、E3泛素连接酶和蛋白酶体的含量和活性。研究结果1.动物模型的建立以及神经行为学指标的变化给予HD染毒后,动物逐渐出现肌肉松弛、肌张力降低、步态异常以至瘫痪等症状,神经行为学测试表明染毒大鼠呈现典型的中毒性周围神经病特征,这提示正己烷中毒性周围神经病模型建立成功。对照组大鼠体重在实验过程中稳定上升,体重增加了85.9%;HD染毒后动物体重增长较对照组明显缓慢。200 mg/kg HD剂量组大鼠体重增加与对照组相比明显减慢,实验结束时约为对照组的73.8%,差异均有统计学意义（P＜0.01）。400 mg/kg HD剂量组大鼠体重不再增长,反而出现下降现象,8周染毒结束时,平均体重约为对照组的41.4%。200和400 mg/kg HD染毒后,大鼠均出现明显的步态异常,步态评分增高。染毒8周,200 mg/kg HD剂量组大鼠出现中度的共济失调和后肢无力,评分平均为2.65±0.4。400 mg/kg HD剂量组大鼠症状较重,试验结束时大鼠出现明显的后肢无力、拖拉、完全无法站立,并最终累及到前肢,平均步态评分为4.00±0.00。2.HD染毒大鼠神经组织和血清中细胞骨架蛋白含量的变化2.1 NFs亚单位在神经组织上清和沉淀中的变化与对照组相比,HD中毒大鼠大脑、脊髓和坐骨神经匀浆上清中,NF-L含量在200 mg/kg HD染毒组分别下降了65.9%、78.3%和38.6%,在400 mg/kg HD染毒组分别下降了74.6%、83.6%和58.4%;NF-M含量在200 mg/kg HD染毒组分别下降了24.8%、80.9%和24.9%,在400 mg/kg HD染毒组分别下降了37.6%,89.3%和60.4%;pNF-H含量在200 mg/kg HD染毒组分别下降了64.9%,38.4%and 38.0%,在400 mg/kg HD染毒组分别下降了71.3%,63.1%and 44.1%;p&n-pNF-H在200mg/kg HD染毒组分别下降了37.8%,52.8%and 37.1%,在400 mg/kg HD染毒组分别下降了56.3%,69.5%and 53.4%。200和400 mg/kg HD染毒导致NF-L含量在大鼠大脑、脊髓和坐骨神经匀浆沉淀中分别下降了28.6%、42.6%、36.1%和42.2%、52.5%、58.4%;NF-M含量分别下降了40.3%、42.1%、29.1%和57.1%、49.4%、52.1%;pNF-H含量分别下降了48.2%、35.0%、43.1%和55.1%、48.1%、65.9%;p&n-pNF-H含量分别下降了41.4%、34.9%、31.2%和57.7%、48.8%、51.4%。2.2神经组织NFs蛋白的变化与大鼠神经行为异常之间的相关性神经组织中NF-L、NF-M和pNF-H的改变与大鼠步态评分之间有明显的负相关性。在大脑、脊髓和坐骨神经组织匀浆上清中NF-L与大鼠步态评分的相关系数分别为-0.916、-0.891和-0.935;NF-M与大鼠步态评分的相关系数分别为-0.838、-0.865和-0.895;pNF-H与大鼠步态评分的相关系数分别为-0.850、-0.894和-0.815。在大脑匀浆沉淀中NF-L、NF-M和pNF-H的变化与大鼠步态评分的相关系数分别为-0.840、-0.915和-0.874;脊髓沉淀中NF-L、NF-M和pNF-H的变化与大鼠步态评分的相关系数分别为-0.885、-0.870和-0.904;坐骨神经组织沉淀中NF-L、NF-M和pNF-H的变化与大鼠步态评分的相关系数分别为-0.921、-0.918和-0.903。2.3α-tubulin、β-tubulin和β-actin含量在神经组织上清和沉淀中的变化HD中毒后α-tubulin、β-tubulin和β-actin蛋白含量在大鼠大脑、脊髓和坐骨神经组织上清和沉淀中发生了不一致的变化。在脊髓和坐骨神经组织上清中,α-tubulin含量在400 mg/kg HD染毒组分别下降了24.4%和44.8%,而在大脑组织上清中无明显变化。与对照组相比,β-tubulin含量在200mg/kg HD染毒组大鼠脊髓和坐骨神经上清中分别下降了16.8%和17.6%,在400 mg/kg HD染毒组分别下降了21.8%和40.7%,但是在大脑组织上清中200和400 mg/kg HD染毒组分别升高了14.1%和17.1%。β-actin的变化与β-tubulin非常相似。400 mg/kg HD染毒导致大鼠坐骨神经组织上清中β-actin含量下降29.2%,在大脑组织上清中升高17.7%。α-tubulin在400 mg/kg HD染毒大鼠大脑、脊髓和坐骨神经组织匀浆沉淀中分别下降了19.2%、7.3%和35.8%。β-tubulin含量在200和400 mg/kg HD染毒大鼠坐骨神经沉淀中也分别下降了28.2%和43.9%,但在大脑和脊髓沉淀中保持不变。β-actin含量在400 mg/kg HD染毒大鼠大脑和坐骨神经沉淀中也分别下降了14.7%和38.2%。2.4神经组织α-tubulin、β-tubulin和β-actin蛋白的变化与大鼠神经行为异常之间的相关性坐骨神经组织中α-tubulin、β-tubulin和β-actin的改变与大鼠步态评分之间有明显的负相关性,而在大脑和脊髓组织中与步态评分无相关性。坐骨神经上清中α-tubulin、β-tubulin和β-actin与大鼠步态评分之间的相关系数分别为-0.874、-0.851和-0.876;沉淀中与大鼠步态评分之间的相关系数分别为-0.922、-0.870和-0.857。2.5血清中细胞骨架蛋白的变化pNF-H含量在200和400 mg/kg HD染毒大鼠血清中分别升高了33.5%和59.8%。NF-L含量在400 mg/kg HD染毒大鼠血清中也明显升高了,但是NF-M、α-tubulin、β-tubulin和β-actin含量未出现明显改变。2.6血清中NFs蛋白的变化与大鼠步态异常之间的相关性为确定血清中pNF-H的变化是否可反映HD中毒性神经病的进展,我们检测了中毒大鼠血清中NFs蛋白的变化与大鼠步态评分之间的相关性。血清中pNF-H变化与大鼠步态评分之间有明显的正相关性,相关系数为0.943。3.NFs相关蛋白激酶在神经组织胞浆和胞膜组分中的变化3.1 CaM,CaMKII,PKA和PKC的含量和活性在神经组织胞浆和胞膜组分中的变化HD染毒导致CaM、CaMKII、PKA和PKC含量在大脑、脊髓和坐骨神经胞浆蛋白组分中明显升高。与对照组相比,CaM含量在200 mg/kg HD染毒组大鼠坐骨神经胞浆蛋白组分中升高了22.7%,在400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑、脊髓和坐骨神经胞浆蛋白组分中分别升高了26.8%、23.9%和46.1%。ELISA试剂盒测定结果与WB结果一致,即CaM含量在400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑、脊髓和坐骨神经胞浆蛋白组分中分别升高了76.9%、62.9%和112.6%。大脑胞浆组分中CaMKII含量也明显升高,在200和400 mg/kg HD染毒组分别升高了23.7和30.3%,但是在脊髓和坐骨神经中未检测到。PKA含量在400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑、脊髓和坐骨神经胞浆蛋白组分中分别升高了21.5%、46.1%和21.0%;PKC含量在脊髓和坐骨神经胞浆蛋白组分中也分别升高23.0%和55.5%,但在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑胞浆蛋白组分中分别下降22.5%和39.4%。CaM含量在200 mg/kg HD染毒组大鼠大脑胞膜组分中升高了28.6%,在400mg/kg HD染毒组大鼠大脑和坐骨神经胞膜组分中也分别升高了18.4%和45.1%。ELISA测定CaM浓度也表现为升高,在400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑和坐骨神经胞膜组分中分别升高了11.1%和25.6%。CaMKII在400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑胞膜组分中也明显升高了26.1%。PKA含量在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠脊髓胞膜组分中分别升高了19.3%和25.5%。虽然PKC含量在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑胞膜组分中分别下降18.4%和21.5%,但在400 mg/kg HD染毒组大鼠脊髓和坐骨神经胞膜组分中分别升高了13.9%和44.7%,CaMKII活性在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠胞浆蛋白组分中分别升高了63.4%和83.7%,但在脊髓和坐骨神经中未检测到。脊髓胞浆蛋白组分中PKA活性在200和400 mg/kg HD染毒组分别下降了25.0%和25.0%,但在200 mg/kg HD染毒组大脑和400 mg/kg HD染毒组坐骨神经中分别升高36.5%和28.1%。PKC活性在200和400 mg/kg HD染毒组大脑和脊髓胞膜蛋白组分中分别下降24.9%、31.0%和27.9%、32.6%,但在坐骨神经胞膜蛋白组分中分别分别升高了8.1%和20.3%。3.2 CaMKII,PKA,PKC活性与大鼠神经行为异常之间的相关性大脑中CaMKII和坐骨神经PKC活性的变化与大鼠步态评分存在明显的正相关性,相关系数分别为0.888和0.765。然而脊髓和坐骨神经中PKA活性与大鼠步态评分存在明显的负相关性,相关系数分别为-0.772和-0.712。大脑和脊髓中PKC活性与大鼠步态评分也存在明显的负相关性,相关系数分别为-0.742和-0.664。3.3 CDK5和相关激活因子在神经组织胞浆和胞膜蛋白组分中的变化CDK5含量在400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑胞浆和胞膜蛋白组分中分别下降了43.4%和17.3%。CDK5活性的变化与含量变化一致,即在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑胞浆组分中分别下降了9.1%和15.2%。CDK5含量在200和400mg/kg HD染毒组大鼠脊髓胞浆（78.2%和21.9%）和胞膜蛋白（26.3%和12.7%）组分中明显升高,但活性却明显下降。200和400 mg/kg HD染毒组大鼠坐骨神经中CDK5含量也明显升高,在胞浆组分中分别升高了26.1%4和41.5%;其活性在胞浆组分中分别升高14.7%和37.6%,在胞膜蛋白组分中分别升高了9.0%和28.8%。与对照组相比,p35前体含量在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑胞浆组分中分别下降17.0%和37.6%,在胞膜蛋白组分中分别下降19.6%和23.0%;p25含量在大脑胞浆组分中分别下降26.5%和51.2%,在胞膜蛋白组分中分别下降12.6%和36.4%;p35含量在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑胞浆组分中也分别下降了11.9%和39.9%。然而p35前体、p35和p25在脊髓胞浆和胞膜蛋白组分中改变不一致,即在胞浆蛋白组分中升高,在胞膜蛋白组分中下降。另外,p35前体含量在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠坐骨神经胞浆组分中分别升高38.1%和16.9%,在胞膜蛋白组分中分别下降59.2%和26.3%;p35和p25在400 mg/kg HD染毒组大鼠坐骨神经胞浆组分中分别升高28.3%和14.4%。3.4 CDK5活性与大鼠神经行为异常之间的相关性在大脑、脊髓和坐骨神经胞浆蛋白组分中CDK5活性与大鼠步态评分之间存在明显的相关性,相关系数分别为-0.746、-0.860和0.864。坐骨神经胞膜蛋白组分中CDK5活性与大鼠步态评分之间存在明显的正相关性,相关系数为0.851,大脑和脊髓中CDK5活性与大鼠步态评分之间无明显相关性。4.神经组织中NFs亚单位聚合率的变化NF-L的聚合率在200 mg/kg HD染毒组大鼠大脑、脊髓和坐骨神经中分别增加27.1%、38.0%和11.2%;在400 mg/kg HD染毒组分别增加了63.7%、51.6%和15.6%。NF-M聚合率在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑明显下降了11.7%和18.9%;而在脊髓中分别升高了51.5%和65.0%;坐骨神经中分别升高了-3.2%（P＞0.05）和9.5%。pNF-H聚合率在200和400 mg/kg HD染毒组大鼠大脑分别升高了16.4%和23.5%;脊髓中分别升高了2.3%（P＞0.05）和7.9%。p&n-pNF-H聚合率在400 mg╱kg HD染毒组大鼠大脑、脊髓和坐骨神经中也明显升高,分别升高了16.6%、24.0%和13.7%。5.UPS在HD中毒性神经病NFs含量下降中的作用5.1 MG132部分地抑制了HD促进NFs降解在表达NF-M的HEK293细胞中（转染0.5 ug Flag-NFM质粒）中,NF-M含量在加入CHX 0、1、4和8小时后分别下降了4.2%、15.7%、23.2%和47.9%,可见NF-M蛋白半衰期大约是12 h。加入4 mM和8 mM HD后NF-M含量降低更加明显,说明HD中毒可加速NFM的降解。HD染毒30 min后,加入蛋白酶体抑制剂MG132,NF-M含量与未加MG132以前比较降解明显减缓。5.2 HD作用下C末端Hsc70反应蛋白（carboxyl terminus of the Hsc70-interactingprotein,CHIP）作为含U-box结构域的E3连接酶增强NF-M泛素化,并促进其通过蛋白酶体降解Flag-NFM、Myc-CHIP和/或HA-Ub质粒分别/同时转染HEK293细胞,经EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel免疫沉淀后,在同时转染Flag-NFM、HA-Ub和Flag-NFM、HA-Ub、Myc-CHIP抗HA反应阳性,且同时转染Myc-CHIP质粒的细胞裂解液中NF-M蛋白的泛素化程度较转染Flag-NFM和HA-Ub的细胞裂解液强,加入HD后可见泛素化程度更强的NF-M蛋白。在同时转染Flag-NFM和增加量的Myc-CHIP质粒的细胞裂解液中,随着CHIP蛋白表达量的升高,NF-M蛋白的含量逐渐下降,HD染毒后降低更加明显,蛋白酶体抑制剂MG132可部分地阻断NF-M蛋白含量的下降,表明HD可增强CHIP促NF-M泛素化并通过蛋白酶体降解。5.3神经组织中泛素活化酶E1、CHIP和蛋白酶体含量的变化与对照组相比,200mg/kg HD组大鼠E1含量在大脑和脊髓中分别下降了15.8%和24.3%（P＜0.01）,但在400mg/kg组分别升高了7.2%（P＞0.05）和29.1%（P＜0.01）;E1含量在200和400mg/kg染毒组大鼠坐骨神经组织匀浆中均明显升高,分别升高了14.9%和59.8%,与对照组相比差异有统计学意义。HD染毒后坐骨神经组织匀浆中CHIP含量明显升高。与对照组相比,200和400mg/kg组大鼠坐骨神经中CHIP含量分别升高了18.3%和55.3%,与对照组相比差异有统计学意义;但在大脑和脊髓中未检测到CHIP蛋白的存在。HD染毒后,大脑、脊髓和坐骨神经组织匀浆中蛋白酶体含量均出现明显升高的趋势。与对照组相比,200mg/kg组大鼠蛋白酶体含量在大脑、脊髓和坐骨神经中分别升高了37.7%、25.8%和18.4%,与对照组相比差异有统计学意义;在400mg/kg组中分别升高了56.4%、86.3%和37.9%,与对照组相比差异有统计学意义。结论1.NFs比微管和微丝更加敏感,易受HD损伤,可能是正己烷中毒性神经病的分子靶点。2.pNF-H含量在HD中毒大鼠血清中明显升高,并与大鼠神经行为异常呈明显的相关性,表明pNF-H可作为HD中毒性神经病早期诊断的生物标志物。3.HD中毒导致大鼠神经组织CaM、PKA、PKC和CDK5的含量和活性以及NFs聚合率的变化,表明NFs相关蛋白信号通路和NFs磷酸化状态改变可能参与了HD中毒性神经病的发生。4.由于CaMKII在脊髓和坐骨神经组织中为检测到,说明Ca2+-CaM-CaMKII-NFs磷酸化信号通路可能部分地参与了HD中毒性神经病发生。5.PKA、PKC和CDK5活性在中枢神经系统和外周神经系统能够变化不一致,可能决定了NFs在中枢神经系统和外周神经系统通过不同的途径降解。6.CHIP作为一种含U-box结构域的E3连接酶促进NFs泛素化并通过蛋白酶体降解。7.蛋白酶体抑制剂MG132部分地抑制了HD促进NFs降解,说明UPS通路在HD中毒性神经病中NFs含量下降中发挥了部分作用。
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