根癌农杆菌介导的rolB基因转化烟草的研究

论文摘要

本研究首先以烟草的带芽茎段为外植体进行不定芽的诱导分化、生长及生根成苗试验。在组织培养的各个阶段的培养基中,附加不同种类及不同质量浓度的激素组合,观察测量外植体在各种培养基中的生长情况,从中筛选出最优的激素配比培养基,从而建立了烟草的高效植株再生体系。在此基础上,将不同质量浓度梯度的卡那霉素加入叶片的愈伤组织及不定芽分化阶段的培养基中,观测卡那霉素对外植体生长的影响,以确定各阶段的最低致死质量浓度,用于烟草的遗传转化研究。然后对根癌农杆菌介导的rolB基因烟草的遗传转化的条件进行了深入探索,在对影响根癌农杆菌转化效率的多种因素比较研究后,发现选择合适的预培养天数、菌液浓度、侵染时间、共培养天数和抗生素的浓度均直接影响根癌农杆菌转化的效率。通过优化这些转化条件,建立了烟草遗传转化的系统。最后在此基础上,对转基因烟草进行PCR检测,验证rolB基因的插入情况。研究结果摘要如下：1.烟草组培再生体系的建立：消毒的最佳方法为先用75%酒精浸泡1min,再用0.1%氯化汞浸泡7min。最佳诱导不定芽的培养基为MS+6BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L。生根培养的最佳培养基为1/2MS+NAA1.0mg/L。移栽炼苗以土壤：蛭石：珍珠岩=2：1：1作为最佳基质。2.烟草遗传转化体系的建立试验结果表明：烟草叶片预培养3d,将处于生长对数期的农杆菌菌液稀释30倍,侵染5min后,共培养3d,然后在含500mg/L羧苄青霉素、80mg/L卡那霉素的诱导分化培养基上进行筛选,长出抗性芽后再进行生根筛选,可获得高转化效率。本实验对根癌农杆菌转化条件进行了比较系统的研究,是为了建立转化效率高、稳定性好的烟草农杆菌转化技术体系。3.转基因植株的分子检测对烟草转化植株的检测主要采用PCR方法。以抗性植株的总DNA为模板,以未转化的植株为阴性对照,以质粒DNA为阳性对照,利用外源基因的特异引物进行PCR扩增。结果表明,转基因植株扩增的条带和质粒中的目的条带一致,而未转化植株没有扩增出任何条带,66.7%的抗性植株为PCR阳性植株,这就证明了rolB基因已转化并整合到烟草基因组中。最后再对转基因烟草及后代的表型形态和细胞学观察,证明外源基因已整合到烟草基因组中并能稳定遗传给下一代。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 1 绪论
• 1.1 植物基因工程进展
• 1.1.1 植物基因工程的现状
• 1.1.2 转基因植物的研究发展历程
• 1.2 植物遗传转化的方法及特点
• 1.2.1 农杆菌介导法
• 1.2.2 直接导入法
• 1.3 转基因植物的筛选与检测
• 1.3.1 转基因植物的筛选
• 1.3.2 转基因植物的检测
• 1.4 外源基因在转基因植物中的遗传稳定性
• 1.5 rol基因的研究进展
• 1.5.1 rol基因研究的现状
• 1.5.2 rol基因研究的意义
• 1.5.3 rolA基因
• 1.5.4 rolB基因
• 1.5.5 rolC基因
• 1.5.6 rolD基因
• 1.5.7 rol基因研究的展望
• 1.6 转基因植物的安全性和应用前景
• 1.7 本研究的主要内容、目的与技术路线
• 1.7.1 本研究的主要内容和目的
• 1.7.2 研究的技术路线
• 2 实验仪器、材料与方法
• 2.1 仪器设备
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 转化烟草受体材料
• 2.2.2 菌株及双元载体
• 2.3 培养基与试剂
• 2.3.1 培养基
• 2.3.2 常用的储存液
• 2.3.3 常用试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 烟草组培再生体系的建立
• 2.4.2 卡那霉素敏选择压力的筛选
• 2.4.3 根癌农杆菌介导烟草转化体系的建立
• 2.4.4 植物遗传转化的培养基
• 2.4.5 影响遗传转化体系因素的筛选和优化
• 2.4.6 转基因烟草总DNA的PCR检测
• 2.4.7 转基因烟草及后代的表型形态和细胞学观察
• 3 结果与分析
• 3.1 烟草组培再生体系的建立
• 3.1.1 诱导培养基对不定芽或愈伤组织的影响
• 3.1.2 生根培养
• 3.2 卡那霉素敏选择压力的筛选
• 3.3 影响遗传转化体系因素的筛选和优化
• 3.3.1 预培养时间对转化效率的影响
• 3.3.2 菌液稀释浓度对转化效率的影响
• 3.3.3 侵染不同时间对转化效率的影响
• 3.3.4 共培养时间对转化效率的影响
• 3.3.5 转基因烟草的获得
• 3.3.6 转基因烟草的移栽
• 3.4 根癌农杆菌介导烟草的分子检测
• 3.4.1 转基因烟草叶片再生的卡那霉素抗性鉴定
• 3.4.2 转基因烟草的PCR检测结果
• 3.4 转基因烟草及后代的表型形态和细胞学观察
• 3.4.1 转基因烟草种子在抗性培养基中的萌发试验结果
• 3.4.2 转基因烟草当代和后代表型形态的观察
• 3.4.3 植物组织石蜡切片制作及显微结构观察
• 4 讨论与总结
• 4.1 讨论
• 4.1.1 优化了烟草组培快繁体系
• 4.1.2 影响遗传转化体系因素的筛选和优化
• 4.1.3 根癌农杆菌介导烟草的分子检测
• 4.1.4 外源基因的稳定性
• 4.2 总结
• 4.2.1 优化了烟草组培快繁体系
• 4.2.2 优化了遗传转化体系
• 4.2.3 获得了转rolB基因烟草的植株
• 4.3 本论文的创新点与进一步研究内容
• 参考文献
• 附录A （图版）
• 附录B （表格）
• 攻读学位期间的主要学术成果
• 致谢