马铃薯PPase基因克隆及其遗传转化研究

论文摘要

马铃薯块茎休眠是一个非常复杂的生物学过程,众多的环境、生理和遗传因子对生产和储藏过程中马铃薯的休眠和发芽都有直接和间接的影响,目前对其机理还不完全清楚。马铃薯块茎的休眠和发芽对于马铃薯的栽培、块茎生产和加工工业都极为重要。无机焦磷酸酶（pyrophosphatase,PPase）是以无机焦磷酸（pyrophosphate,PPi）为底物的水解酶。植物体内糖代谢途径的多步反应都是以焦磷酸（PPi）为协同因子（co-substrate）,PPi含量的高低可将细胞质中蔗糖的合成反应和质体中淀粉的分解反应有机协调起来,它是蔗糖合成途径的重要调控点之一。通过无机焦磷酸酶来改变PPi的含量可以实现糖代谢途径的调控,从而调控马铃薯块茎的休眠与发芽特性。本研究采用RT-PCR技术,从马铃薯栽培品种大西洋（Atlantic）叶片中克隆了PPase基因,分别构建了组成型启动子CaMV 35S、块茎特异表达启动子CIPP和低温诱导表达启动子rd29A驱动的反义PPase基因植物表达载体,然后采用农杆菌介导法转化优良马铃薯栽培品种,获得了转基因马铃薯。取得的主要研究结果如下:1.从马铃薯栽培品种大西洋叶片中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增到马铃薯无机焦磷酸酶（PPase）基因cDNA,序列分析结果表明该cDNA全长673 bp,开放阅读框架636 bp,编码211个氨基酸。该PPase基因已在GenBank中登记,登记号为EF091820。Blast同源性比较和分析表明,该cDNA与已发表的PPase基因（GenBank accession Z36894）同源性为97.62%。2.采用酶切和连接的方法,构建了强组成型启动子CaMV 35S、块茎特异性表达启动子CIPP和低温诱导表达启动子rd29A驱动的反义PPase基因植物表达载体pBIAP、pBCAP和pBrAP。3.利用构建好的表达载体pBIAP、pBCAP和pBrAP,用农杆菌介导法将反义PPase基因导入早熟品种费乌瑞它（Favorita）和晚熟品种甘农薯2号中,获得了转化植株及其试管薯,通过PCR检测初步证明PPase基因已导入马铃薯中。

论文目录

• 缩略语表
• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1.1 马铃薯块茎休眠与发芽
• 1.1.1 马铃薯块茎的形成
• 1.1.2 马铃薯块茎休眠与发芽
• 1.1.3 块茎休眠和发芽的调控因素
• 1.1.4 马铃薯块茎休眠与发芽调控研究
• 1.2 无机焦磷酸（PPi）
• 1.2.1 植物体内的磷代谢
• 1.2.2 植物体内的焦磷酸（PPi）
• 1.3 马铃薯无机焦磷酸酶（PPase）及其基因克隆研究
• 1.3.1 无机焦磷酸酶（PPase）的作用
• 1.3.2 无机焦磷酸酶（PPase）基因研究
• 1.4 基因工程技术在调控马铃薯块茎休眠与发芽中的应用
• 1.5 本研究的意义
• 第二章 马铃薯无机焦磷酸酶基因cDNA 克隆
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 菌种
• 2.2.3 酶和试剂
• 2.2.4 培养基
• 2.3 方法
• 2.3.1 马铃薯叶片总RNA 提取
• 2.3.2 RT-PCR 扩增马铃薯无机焦磷酸酶（PPase）基因 cDNA
• 2.3.3 克隆载体的质粒DNA 制备
• 2.3.4 质粒DNA 的酶切、回收和连接
• 2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.3.6 转化子蓝白斑筛选与鉴定
• 2.3.7 序列分析及比较
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 马铃薯叶片总RNA 提取和质量检测
• 2.4.2 PPase 基因cDNA 的扩增
• 2.4.3 PPase 基因克隆重组子的筛选
• 2.4.4 PPase 基因重组子pSKAP 的鉴定
• 2.4.5 PPase 基因序列分析
• 2.5 讨论
• 第三章 反义PPase 基因植物表达载体的构建
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.3 方法
• 3.3.1 表达载体的构建
• 3.3.2 重组体的筛选与鉴定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 CaMV 35S 启动子驱动的PPase 基因表达载体构建
• 3.4.2 CIPP 启动子驱动的PPase 基因表达载体构建
• 3.4.3 rd29A 启动子驱动的PPase 基因表达载体构建
• 3.5 讨论
• 第四章 反义PPase 基因转化马铃薯试管薯的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 菌株与质粒
• 4.2.3 酶和试剂
• 4.2.4 培养基
• 4.3 方法
• 2法）'>4.3.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 4.3.2 根癌农杆菌感受态细胞的冻融法转化
• 4.3.3 微量碱法提取农杆菌Ti 质粒DNA
• 4.3.4 表达载体导入农杆菌的PCR 法鉴定
• 4.3.5 马铃薯试管薯的诱导
• 4.3.6 农杆菌介导的马铃薯试管薯的遗传转化
• 4.3.7 植物基因组总DNA 的提取
• 4.3.8 卡那霉素抗性植株的PCR 检测
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 表达载体导入农杆菌的PCR 鉴定
• 4.4.2 马铃薯试管薯的诱导
• 4.4.3 马铃薯试管薯的转化
• 4.4.4 转基因马铃薯在Kan 培养基上生根
• 4.4.5 转基因植株的PCR 鉴定
• 4.5 讨论
• 第五章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 马铃薯块茎休眠发芽与生产
• 5.1.2 基因工程技术调控马铃薯块茎休眠与发芽
• 5.1.3 PPase 基因克隆及反义植物表达载体构建
• 5.1.4 转反义PPase 基因马铃薯的获得
• 5.2 结论
• 5.2.1 PPase 基因cDNA 的克隆
• 5.2.2 反义PPase 基因植物表达载体的构建
• 5.2.3 农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化
• 5.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 在读硕士期间发表论文
• 导师简介