反枝苋生防菌株改良及除草活性化合物的分离纯化

论文摘要

植物病原菌真菌产生的寄主专化性毒素针对地作用于目标植物,因而研究利用植物病原菌产生的寄主专化性毒素作为生物源化学除草剂来控制杂草,是未来化学除草剂研究的开发方向之一,具有广阔的发展前景。反枝苋是世界恶性杂草之一。该杂草在我国主要危害大豆、玉米、高粱、棉花、花生等旱田作物。反枝苋专化链格孢Alternaria amaranthi-3是本试验室筛选出的一微生物除草剂候选菌株。为了进一步提高A.amaranthi-3开发潜力,本研究采用物理诱变、化学诱变和复合诱变技术对菌株进行改良,并对菌株产生的杀草活性化合物进行了分离纯化。该研究取得了以下结论:1.经紫外诱变,化学诱变,复合诱变对A.amaranthi-3进行菌种改良,共获得74株突变菌株。通过筛选获得1株正突变菌株X4。突变菌株X4与原始菌株A.amaranthi-3相比,菌落生长速率较快,气生菌丝较多,疏松,颜色为青色,菌落边缘为白色。突变菌株X4培养7 d的产孢量较原始菌株提高了81.2%,其液体发酵液对反枝苋胚根抑制率提高了26.39%;经过7次连续传代培养后,每一代的菌落生长速度明显高于原始菌落,并且菌落每一代的直径长度稳定,培养7 d时,菌落直径均达到8.97～9 cm,其每一代的菌丝产量和毒素产量相对也稳定。2.确定了突变菌株X4产毒的最佳液体培养基为PSK培养基;最佳培养温度为25℃;最适pH为4.15～6.15;最佳培养时间为3～5 d。确定了菌株最佳毒素产量的培养方式,即菌株在25℃条件下,振荡培养（转速为120 r/min）3 d,然后黑暗静置培养2 d。3.本试验确定了乙酸乙酯为毒素最佳萃取有机溶剂。乙酸乙酯的毒素萃取回收率高达91.07%。本试验研究表明,贮存时间、高温以及pH对突变菌株X4粗毒素活性无影响。4.利用生物测定为导向的色谱分离纯化方法对突变菌株X4产生的毒素进行分离纯化。采用胚根伸长生长抑制法对各洗脱液生物活性进行检测。结果表明,石油醚︰乙酸乙酯=5︰4洗脱的3-9瓶洗脱液,石油醚︰乙酸乙酯=4︰6洗脱的1-6瓶洗脱液和石油醚︰乙酸乙酯=5︰2洗脱的4-6瓶洗脱液具有生物活性。依据活性组分的分布情况,初步确定突变菌株X4的培养滤液至少含有两种活性成分。石油醚︰乙酸乙酯=5︰4洗脱的3-9瓶和石油醚︰乙酸乙酯=4︰6洗脱的1-6瓶合并为组分Ⅰ和石油醚︰乙酸乙酯=5︰2洗脱的4-6瓶合并为组分Ⅱ。对具活性组分Ⅰ用不同的展开剂进行薄层层析,根据紫外检测展开效果,以氯仿︰甲醇︰氨水=30︰20︰1为展开剂分离效果较好,分离组分的Rf值较合理,在365 nm下可见到4个荧光斑点。经反枝苋叶片生物活性测定,Rf值为0.35的斑点对反枝苋叶片具有毒性。经过多次薄层层析和乙酸乙酯重结晶,获得毒素晶体40 mg。显微观察结果表明,该毒素为柱状晶体。该毒素熔程为186～189℃,紫外谱分析结果表明,该毒素在292 nm处有较强的吸收峰。5.本试验利用种子萌发,胚根伸长生长抑制及离体叶片针刺法对纯化的毒素化合物活性进行了测定。结果表明,毒素对反枝苋的毒害明显存在的剂量反应关系,即随着毒素浓度的增加对反枝苋的致病活性增强;毒素引起反枝苋叶片的黄褐色病斑与其产生菌侵染反枝苋时产生的病斑相似,表明毒素在反枝苋的致病过程中起着重要作用。当毒素浓度为200μg.mL-1时,反枝苋种子几乎不萌发,其萌发率仅仅为8.67%;反枝苋胚根对毒素较敏感,当毒素浓度为100μg.mL-1时,毒素对反枝苋胚根抑制率为88.93%,当毒素浓度为200μg.mL-1时,反枝苋胚根几乎不伸长;毒素也可引起反枝苋叶片坏死,用浓度为200μg.mL-1毒素处理带伤口的反枝苋叶片48 h后,叶片出现黄褐色坏死斑,其病症与其病原菌侵染反枝苋时产生的病症相似。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 反枝苋生物特性，危害及分布
• 1.2 利用天然活性化合物开发除草剂的研究进展
• 1.3 菌种改良
• 1.4 植物病原真菌毒素
• 1.5 天然产物除草剂面临的问题与展望
• 1.6 研究的目的和意义
• 第二章 反枝苋链格孢突变菌株筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与分析
• 第三章 反枝苋链格孢突变菌X4 产毒素条件
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 第四章 粗毒素提取及稳定性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与分析
• 第五章 突变菌株X4 毒素分离与纯化
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与分析
• 第六章 活性组分Ⅰ生物活性测定
• 6.1 材料与方法
• 6.2 结果与分析
• 第七章 讨论与结论
• 7.1 讨论
• 7.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历