多胚柑桔合子胚的显微分离及培养

论文摘要

多胚现象是柑桔研究及育种实践中的一个重要问题，也是柑桔杂交育种最大的障碍，多胚性柑桔品种在杂交育种时，由于珠心胚的干扰抑制，致使有性胚在早期败育死亡，导致育种过程中很难获得真正的杂种苗，使多胚性柑桔杂交育种工作受到很大的限制。因此，探索高效的合子胚分离技术，在合子胚尚未败育之前将其分离出来进行培养，克服珠心胚的干扰，挽救早期败育的合子胚，从而获得杂种苗，提高杂种率，是多胚柑桔杂种实生苗培育的有效途径，具有重要的实践意义。本研究初步建立了多胚性柑桔早期合子胚的显微分离、离体培养及合子苗的鉴定体系，成功显微分离了柑桔早期合子胚并通过离体培养再生植株，具体结果如下：1、多胚性柑桔早期合子胚显微分离的最适时期为授粉后50—55d。利用显微操作系统，采用自制钢针（针尖大小控制在50μm左右）代替传统的微细玻璃针，可提高多胚性柑桔早期合子胚的分离效率。2、MS、White和MT三种基本培养基都适合柑桔早期合子胚的离体培养，柑桔早期合子胚成熟培养的最佳植物生长调节剂浓度配比为IAA1mg／L+BA20mg／L，适当提高培养基中蔗糖浓度（最适浓度为10％）、添加适量水解乳蛋白（最适浓度为400mg／L）有助于柑桔早期合子胚的生长发育。3、固体培养与悬浮培养方式均适合柑桔早期合子胚的成熟培养，但悬浮培养方式更便于观察调控。4、培养成熟的柑桔合子胚转入分化培养时，不需改变成熟培养时的植物生长调节剂配方，只需将蔗糖浓度降至2％，由暗培养改为光照培养即可自然再生植株。在此基础上若添加少量ZT（0.2mg／L），能促进合子胚再生植株的速度。由成熟培养转入分化培养，再生植株的最佳时期为：a、固体培养的合子胚及其次生胚发育至子叶状形态出现时，即可认为是发育成熟，可以转接至分化培养基中再生植株。b、液体培养的合子胚子叶长度大约在1—1.5cm（培养时间约8星期）时，即可认为是发育成熟，可以转接至分化培养基中再生植株。5、经反复实验，确立了适合柑桔基因组DNA的快速提取方法和PCR反应的优化体系，筛选出6条扩增多态性较高的引物，对再生小苗进行了RAPD鉴定分析，从73株再生小苗中，鉴定出了61株合子苗，合子苗的比例达到83.6％。综合本研究所有研究结果表明，利用显微操作系统，显微分离多胚性柑桔早期合子胚，并进一步培养再生植株，可获得高比例的合子苗，是排除多胚性柑桔珠心胚的干扰抑制，促进多胚性柑桔有性杂交育种的有效手段。

论文目录

• 中文摘要
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• 缩写词
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 柑桔合子胚培养研究进展
• 1.1 柑桔合子胚的培养
• 1.1.1 成熟种子培养
• 1.1.2 早期幼胚离体培养
• 1.2 柑桔合子胚早期离体培养的影响因素
• 1.2.1 合子胚分离时期对柑桔合子胚培养的影响
• 1.2.2 培养基类型和激素配比对柑桔合子胚培养的影响
• 1.2.3 碳源对柑桔合子胚培养的影响
• 1.2.4 其它因素对柑桔合子胚培养的影响
• 2 高等植物显微分离技术应用进展
• 2.1 高等植物染色体的显微分离与微克隆
• 2.2 高等植物细胞的显微分离与细胞周期蛋白研究
• 2.3 高等植物有性生殖细胞的显微分离与离体受精及相关研究
• 2.4 高等植物合子的显微分离及相关研究
• 3 RAPD技术及其在柑桔合子苗鉴定上的运用
• 3.1 柑桔合子苗鉴定简况
• 3.2 RAPD技术及其在柑桔合子苗鉴定上的应用
• 3.2.1 RAPD技术简介
• 3.2.2 RAPD技术在柑桔合子苗鉴定上的应用
• 3.2.3 RAPD技术存在的问题及解决方法
• 第二章 多胚柑桔早期合子胚的显微分离
• 1 试验材料及方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验材料的处理
• 1.3 主要实验仪器
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 合子胚最适分离时期的观察
• 1.4.2 合子胚的显微分离
• 2 结果与分析
• 2.1 合子胚最适分离时期的观察
• 2.2 合子胚的显微分离
• 3 讨论
• 第三章 多胚柑桔早期合子胚的离体培养
• 1 试验材料及方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验材料的处理
• 1.2.1 预备试验材料的处理
• 1.2.2 正式杂交试验材料的处理
• 1.3 主要实验仪器
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 柑桔早期合子胚培养条件的初步优化
• 1.4.2 柑桔早期合子幼胚的成熟培养
• 1.4.3 成熟胚培养再生植株
• 2 结果与分析
• 2.1 柑桔合子胚培养条件的初步优化结果
• 2.2 不同杂交组合合子胚培养情况
• 2.3 柑桔合子幼胚的成熟培养结果
• 2.3.1 柑桔合子幼胚在固体培养基上培养成熟过程
• 2.3.2 柑桔合子幼胚悬浮培养成熟过程
• 2.3.3 不同浓度蔗糖对柑桔合子胚成熟培养的影响
• 2.3.4 水解乳蛋白对柑桔合子胚成熟培养的影响
• 2.4 柑桔成熟合子胚再生植株
• 2.4.1 柑桔成熟合子胚再生植株过程
• 2.4.2 不同植物生长调节剂组合培养基对柑桔成熟合子胚再生植株的影响
• 2.4.3 柑桔成熟合子胚转入光照培养的最佳时机
• 3 讨论
• 第四章 多胚柑桔合子胚的鉴定
• 1 试验材料
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验材料的处理
• 1.3 主要实验仪器与试剂
• 1.3.1 主要实验仪器
• 1.3.2 试剂
• 2 试验方法
• 2.1 形态学比较鉴别柑桔合子苗
• 2.2 RAPD分析鉴定柑桔合子苗
• 2.2.1 柑桔基因组DNA的提取与检测
• 2.2.1.1 柑桔基因组DNA的提取
• 2.2.1.2 柑桔基因组DNA含量和纯度的测定
• 2.2.1.3 柑桔基因组DNA的电泳检测
• 2.2.2 柑桔基因组DNA的RAPD-PCR扩增反应
• 2.2.2.1 RAPD-PCR扩增体系的优化
• 2.2.2.2 RAPD-PCR扩增反应引物的筛选
• 2.2.2.3 RAPD分析鉴定柑桔合子苗
• 3 结果与分析
• 3.1 形态学比较鉴别柑桔合子苗结果与分析
• 3.2 RAPD分析鉴定柑桔合子苗结果与分析
• 3.2.1 柑桔基因组DNA的提取与检测
• 3.2.2 柑桔基因组DNA的RAPD-PCR扩增反应结果与分析
• 3.2.2.1 RAPD-PCR扩增体系的优化
• 3.2.2.2 RAPD-PCR扩增反应引物的筛选
• 3.2.2.3 RAPD分析鉴定柑桔合子苗结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读博士学位期间发表的论文