绵羊miRNA转录组的鉴定与特征分析

论文摘要

microRNA（miRNA），是一类内源性的长约22nt的非编码的单链RNA分子，广泛存在于各种动物、植物和病毒中，主要通过与靶基因mRNA3’非翻译区的碱基互补配对，而发挥沉默特定靶基因的作用。绵羊具有重要的生物价值和经济价值，而绵羊miRNA的研究严重滞后。Texel羊（特克赛尔羊）为典型的“双肌”型绵羊，而乌珠穆沁羊（Ujumqin羊）为我国当地的肉脂型绵羊，这两个在表型上的极端品种是研究肌肉和脂肪生长发育良好的动物模型。本研究采集了Texel羊70d、85d、100d、120d、135d胎儿的背最长肌组织，以及Ujumqin羊70d、85d、100d、120d、135d胎儿与出生0d、35d、70d羔羊的背最长肌组织，进行Texel羊与Ujumqin羊小RNA文库的Solexa深度测序，进一步利用分析软件ACGT101-miR v4.2并结合生物信息学方法，对测序数据进行了深入挖掘。主要结果如下：（1）2个小RNA文库进行高通量测序后，共获得35,700,772条原始序列读数（raw reads）。经过各种质量控制程序处理后，共得到34,964,457条高质量序列读数（即mappable reads）。（2）miRNA的序列长度主要分布在20～24nt，在22nt处达到峰值。并且miRNA主要以其异构体isomiRNA的形式存在。（3）鉴定了7种类型的共2,319条绵羊miRNA，哺乳动物保守的1,103条miRNA，其中绵羊已知的96条miRNA，新发现的绵羊特异的1,216条miRNA。（4）共鉴定了8种绵羊let-7miRNA，并且与其他12种哺乳动物的let-7家族miRNA具有相同的种子序列：5’-GAGGTA-3’。（5）鉴定的2,319条绵羊miRNA与其他文献报道的181条绵羊miRNA中的100条（55.25%）序列完全相同。（6）首次构建了绵羊的miRNA基因组图谱，1,879条miRNA定位到了绵羊染色体上的2,436个基因组位置，其中141条miRNA定位到了X染色体上的150个基因组位置。（7）Texel羊与Ujumqin羊的小RNA文库经过miRNASolexa测序后分别得到了16,532,850与19,167,922条raw reads，分别鉴定了1,601与1,694条miRNA。其中两个绵羊品种间差异表达的miRNA为89条，显著差异表达的miRNA为10条。（8）利用TargetScan软件预测到了差异表达的89条miRNA的8,737条靶基因mRNA。（9）通过实时荧光定量PCR技术对显著差异表达的10条miRNA进行了试验验证。本研究进行的绵羊miRNA转录组的鉴定与特征分析，将进一步促进绵羊miRNA功能和基因调控机制的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 microRNA 的发现历程
• 1.3 microRNA 的生物起源与加工成熟
• 1.3.1 miRNA 前体的生物合成
• 1.3.2 miRNA 成熟体的生物合成
• 1.3.3 RNA 诱导沉默复合物（RISC）
• 1.3.4 microRNA 的调控
• 1.4 microRNA 的特征和鉴别
• 1.4.1 microRNA 的特征
• 1.4.2 microRNA 的鉴别
• 1.5 microRNA 的作用机理
• 1.5.1 microRNA 引导的 mRNA 剪切
• 1.5.2 microRNA 引导的 mRNA 翻译抑制
• 1.5.3 microRNA 引导的可逆抑制作用
• 1.6 microRNA 的生物学功能
• 1.6.1 microRNA 对动物骨骼肌分化的作用
• 1.6.2 microRNA 对动物四肢发育的作用
• 1.7 microRNA 与其他非编码 RNA
• 1.7.1 siRNA
• 1.7.2 piRNA
• 1.7.3 lncRNA
• 1.7.4 其他非编码小分子 RNA
• 1.8 研究目的和意义
• 第二章 绵羊 miRNA Solexa 测序
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 试验样品
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要溶液配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 提取总 RNA
• 2.2.2 检测总 RNA 质量
• 2.2.3 构建 RNA 混池
• 2.2.4 构建 cDNA 测序文库
• 2.2.5 miRNA 高通量测序
• 2.2.6 测序数据处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总 RNA 质量检测
• 2.3.2 Solexa 测序结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 试验动物
• 2.4.2 miRNA 检测方法
• 2.4.3 miRNA Solexa 测序质量
• 第三章 绵羊 miRNA 转录组的鉴定与特征分析
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 主要数据库
• 3.1.2 主要分析软件
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 构建数据库
• 3.2.2 miRNA 序列分类
• 3.2.3 miRNA 前体预测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 7 种类型的 miRNA
• 3.3.2 绵羊已知的 miRNA
• 3.3.3 isomiRNA
• 3.3.4 绵羊候选的 miRNA
• 3.3.5 绵羊 miRNA 的基因组定位
• 3.3.6 X 染色体上的 miRNA
• 3.3.7 2 个小 RNA 文库测序结果的比较
• 3.4 讨论
• 3.4.1 miRNA Solexa 测序
• 3.4.2 绵羊 miRNA 转录组
• 3.4.3 miRNA 的发现
• 第四章 绵羊 miRNA 的靶基因预测及 qPCR 验证
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 主要数据库及软件
• 4.1.2 主要仪器及试剂
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 试验数据
• 4.2.2 miRNA 靶基因预测
• 4.2.3 实时荧光定量 PCR
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 miRNA 靶基因预测结果
• 4.3.2 qPCR 试验结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 miRNA 的靶基因预测分析
• 4.4.2 miRNA 的实时定量 PCR 检测
• 第五章 结论
• 1 主要结论
• 2 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历