论文摘要
肥胖、糖尿病、高脂血症和高血压等脂肪代谢异常相关疾病共同构成了代谢综合征（Metabolic Syndrome,MS）,其已成为一类严重危害人类健康的疾病。脂肪是机体储存能量的重要方式,主要以脂滴（Lipid Droplets,LDs）的形式广泛分布于各种组织细胞中。脂滴表面覆盖有单层磷脂,磷脂内部镶嵌多种蛋白质,被称为脂滴相关蛋白。脂滴相关蛋白在脂滴代谢过程中发挥着重要作用,其中PAT蛋白家族是脂滴表面最为重要的结构蛋白,包括perilipin、ADRP（Adipocyte Differentiation-Related Protein）、TIP47、S3-12和LSDP5（Lipid Storage Droplet Protein 5）。LSDP5是PAT家族的最新成员,在以氧化脂肪酸为能量来源的组织（心脏、骨骼肌、肝脏等）中表达水平较高,尤以在心脏表达水平最高。目前LSDP5功能的研究多集中于COS-7细胞、肝细胞等细胞或组织;然而对心脏或心肌细胞内脂肪代谢的影响尚不明确,为了明确其对心脏脂肪代谢的影响,本实验就LSDP5对小鼠心肌细胞内脂滴代谢作用进行了研究。目的明确油酸对心肌细胞内LSDP5 mRNA和蛋白质表达水平的影响,通过构建LSDP5过表达和沉默的重组腺病毒,进而明确LSDP5对心肌细胞脂滴代谢的影响。方法1、分离培养乳鼠心肌细胞,给予不同浓度油酸24h,采用Bodipy 493/503荧光染色观察脂滴变化;分别提取细胞总RNA和蛋白质,采用Real-time PCR和Western blot技术检测细胞内LSDP5 mRNA和蛋白质的表达情况。2、利用AdEasyTMXL腺病毒载体系统构建分别能够过表达和沉默LSDP5的重组腺病毒Ad-HA-LSDP5和Ad-si-LSDP5。将pCMV5-HA质粒和pSilencer-si-LSDP5质粒分别连接至穿梭载体pShuttle,酶切线性化后转化至BJ5183感受态细胞中进行同源重组,筛选阳性克隆,提取质粒,酶切线性化并转染AD293细胞,提取重组腺病毒,分别用PCR和Western blot技术鉴定,扩增病毒并检测病毒滴度。3、利用构建的重组腺病毒分别感染心肌细胞,Western blot检测重组腺病毒对LSDP5表达的影响。同时用100μM/L油酸诱导和Bodipy 493/503染色观察各组脂滴形态。结果1、分离的乳鼠心肌细胞经油酸刺激后,细胞内脂滴增大,同时LSDP5的mRNA转录和蛋白表达水平升高。2、重组腺病毒Ad-HA-LSDP5和Ad-si-LSDP5病毒经PCR扩增显示,前者可扩增出1400bp左右的片段,后者未能扩增出目的条带。重组腺病毒分别感染AD293细胞,Western blot检测显示,二者分别能使细胞内LSDP5过表达和沉默。3、构建的腺病毒能有效地在心肌细胞内过表达或沉默LSDP5。病毒感染乳鼠心肌细胞并给予100μM/L油酸刺激后,过表达LSDP5的细胞内脂滴的数量增加,体积增大;沉默LSDP5的细胞内脂滴的数量减少,体积减小。结论初步明确了LSDP5在心肌细胞脂滴形成过程中的表达变化。成功地构建了重组腺病毒Ad-HA-LSDP5和Ad-si-LSDP5,并确定了在心肌细胞中过表达LSDP5能够促进细胞内脂滴的形成,为深入研究LSDP5在脂滴代谢过程中的作用及机制提供了研究基础。