论文摘要
目的：利用分子遗传学的方法构建一种全基因组随机基因突变调控技术平台,并通过该技术筛选和鉴定控制胰腺癌转移有因果关系的关键候选基因和遗传通路,为进一步研究恶性肿瘤转移的分子病理机理打下基础,为胰腺癌的临床诊断、治疗和预防提供新的靶点和策略。方法：选择低转移性人胰腺癌细胞株AsPC-1为研究对象,建立包含四环素基因调控系统转录激活子（transactivator, tTA or Tet-off）的AsPC-1稳定表达细胞株；构建基于piggyBac转座子（PB）并含有双份四环素反应元件（double tetracycline responsive element,2TRE,14Tet）的基因搜寻载体（GSV）；通过脂质体共转染方法将GSV质粒和mPB质粒导入Tet-off稳定表达细胞系,经G418筛选后获得全基因组范围内的纯合细胞随机基因突变文库,并鉴定所得突变库的特点；通过裸鼠体内移植模型筛选和鉴定高转移性AsPC-1细胞；利用Splinkette PCR法从高转移性细胞株中克隆GSV插入位点确定候选基因,并进行生物信息学分析；功能验证上述候选突变基因与高转移表型的因果关系,分析候选基因在癌症转移中的临床意义、作用和分子机理。结果：建立了稳定和高效表达tTA的Tet-off人胰腺癌细胞株AcPC-1-2D2、AsPC-l-2B6与AsPC-1-5A3,其受Dox的调控倍数均超过100倍；成功组建了基于piggyBac基因搜寻载体（PB-GSV）,在AcPC-1-2D2中建立了全基因组纯合细胞随机基因突变文库,含有100多万个突变克隆；经鉴定PB-GSV在基因组上整合范围广、转座效率高和偏向突变编码基因,是一种理想的基因搜寻工具；利用裸鼠体内筛选得到14株高转移性胰腺癌细胞株,克隆到16个肿瘤转移相关的候选基因,包括3个已知与肿瘤转移密切相关和13个新发现的基因；并对ARPC1B基因进行了功能验证和机理研究,结果表明其能促进细胞生长和运动,与胰腺癌肺转移具有直接的因果关系。结论：成功构建了全基因组随机突变调控技术平台并利用它筛选得到了多个控制胰腺癌转移的候选基因,功能验证和机理研究显示ARPC1B基因是胰腺癌肺转移中的关键基因之一；为胰腺癌转移的分子病理机制研究提供了新的切入点,为胰腺癌的临床诊断和靶向治疗提供了潜在的生物标志物和靶点。目的：通过基因工程抗体技术对抗阿尔茨海默病Aβ42鼠源单克隆抗体进行人源化改造,构建和表达抗β-淀粉样多肽人-鼠嵌合抗体和改型抗体,减低鼠源单克隆抗体（mAb）在临床应用中引起的人体免疫排斥反应（HAMA反应）。方法：从分泌抗Aβ鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取总RNA,用RT-PCR扩增抗Aβ鼠单克隆抗体全长基因,对其序列进行分析,确定能与抗原Aβ结合的抗体重轻链可变区基因；利用重组PCR技术拼接重轻链可变区与人IgG1的恒定区基因构建嵌合抗体,在此基础上对嵌合抗体可变区中的框架区改造,获得只保留抗Aβ42鼠源单克隆抗体可变区的改型抗体,并进一步对抗Aβ42嵌合抗体和改型抗体重链Fc段进行定点突变以降低排斥反应；分别构建抗Aβ42人-鼠嵌合基因和改型抗体基因重轻链真核表达载体,用脂质体法将其同时导入COS-7细胞中表达,并对分泌的抗体功能和性质进行初步鉴定。结果：Blast比对分析结果显示克隆的基因序列符合小鼠抗体基因序列,获得全新的能与抗原Aβ结合的可变区基因；将可变区基因与人IgG1的恒定区基因拼接后构建嵌合抗体真核表达载体,共转染COS-7细胞后能分泌抗Aβ的嵌合抗体,其保持了亲本鼠源单克隆抗体的生物学活性；利用固定模板方案设计的抗Aβ改型抗体经真核细胞表达后,所分泌的改型抗体继续保持亲本抗体的生物学特性；利用重组PCR对嵌合抗体和改型抗体Fc进行定点突变并构建重轻链表达载体,并实现真核表达：ELISA和免疫组化实验证实了所分泌抗体的人源性和与Ap的结合特异性。结论：成功地克隆了抗Aβ42鼠源单克隆抗体可变区基因,并实现了对其人源化改造,构建和表达了抗Aβ42嵌合抗体以及改型抗体,为其在阿尔茨海默病的临床诊治中应用和进一步研究奠定了基础。