酿酒酵母甘油合成关键酶基因GPD1及其启动子在烟草中的表达研究

论文摘要

我国干旱、盐碱化和水土流失的问题十分严重,因此选育获得抗旱、耐盐植物新品种具有重大的战略意义。当受到如干旱、盐度、高温或低温等各种不利环境胁迫的影响时,生物体则能通过激活体内酶反应,过量合成相应的产物如甜菜碱、脯氨酸、甘油等来应答环境条件改变,促成体内平衡稳定的重建,并将此类物质称为抗胁迫保护剂。甘油（glycerol）是甘油三酸酯分子的骨架成分,在逆境胁迫条件下,是一种极其理想的细胞内抗胁迫保护剂。同时,3-磷酸甘油脱氢酶（GPDH）作为生物体内甘油合成代谢途径中的限速酶,其直接决定了葡萄糖分解代谢过程中向甘油合成方向的物质流分配量和甘油合成水平。烟草作为一种重要的模式植物,在遗传学,生理和代谢过程等方面发挥了积极的作用,因此烟草已经成为了国内外学者研究的热点。由于烟草合成甘油的能力十分有限,只能耐受一定限度的胁迫,因此本研究意在选育一株能提高烟草甘油合成能力的转基因植株,提高其抗胁迫能力。首先,本实验利用PCR方法从酿酒酵母中克隆得到甘油代谢关键酶基因Scgpd1的启动子PScgpd1,成功构建酵母穿梭表达载体pYX212-zeocin-PScgpd1-gus,通过电击转化法得到转基因酿酒酵母Saccharomyces cerivisiae/ pYX212-zoecin-PScgpd1-gus;实验结果表明:在不同渗透压胁迫下,重组酿酒酵母gus基因的表达有很明显的差异,且在一定胁迫力度范围内,gus基因的表达随着胁迫压力的提高而提高,研究表明启动子PScgpd1受渗透胁迫调节。进而,构建得到重组植物表达载体p3300-zeocin- PScgpd1-gus,电击转化根癌农杆菌LBA4404得到阳性转化子LBA4404/p3300-zeocin-PScgpd1-gus;利用根癌农杆菌LBA4404将PScgpd1（酿酒酵母甘油合成关键酶基因GPD1的启动子）介导转化烟草K326,通过叶圆片转化法获得转基因烟草;通过GUS报告基因在转基因烟草中的表达研究发现:该启动子在烟草不同组织部位中均能启动gus基因的表达,且在一定NaCl盐胁迫范围内,烟叶中gus基因的表达量随着胁迫力度的增加而提高。最后,构建得到重组植物表达载体p3300-zeocin-Scgpd1,电击转化根癌农杆菌LBA4404的到阳性转化子LBA4404/p3300-zeocin-Scgpd1;利用根癌农杆菌LBA4404将Scgpd1介导转化烟草K326,通过叶圆盘转化法获得转基因烟草。在一定NaCl盐胁迫范围内,发现转基因烟叶中的甘油含量和GPDH酶活均能随胁迫力度的增加而提高,且能抵抗一定程度外界环境的盐胁迫。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 植物抗逆性研究进展
• 1.2 甘油的特点及甘油代谢
• 1.2.1 甘油与甘油的特点
• 1.2.2 生物体内的甘油代谢
• 1.3 植物抗逆性启动子的研究
• 1.3.1 启动子的一般特点
• 1.3.2 克隆启动子的方法
• 1.4 常用报告基因简介
• 1.4.1 GUS 报告基因的酶学特性
• 1.4.2 GUS 报告基因的化学分析方法
• 1.5 植物基因工程育种
• 1.5.1 农杆菌介导的植物基因转化技术
• 1.5.2 植物基因转化的受体系统
• 1.6 立题意义与本研究主要任务
• 第二章 pScGPD1启动子融合gus报告基因在酿酒酵母中瞬时表达的研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 工具酶和试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌体的培养
• 2.2.2 染色体DNA 制备
• 2.2.3 PCR 引物
• 2.2.4 PCR 反应体系及反应条件
• 2.2.5 PCR 产物胶回收
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7 pScGPD1 及gus 与pMD-18T 连接
• 2.2.8 转化
• 2.2.9 质粒DNA 的提取
• 2.2.10 转化子的筛选鉴定
• 2.2.11 酿酒酵母S. cerevisiae/pYX212-zeocin-pScGPD1-gus 基因工程菌的构建
• 2.2.12 SDS-PAGE
• 2.2.13 GUS 瞬时表达的荧光法测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 pMD-18T- pScGPD1 和pMD-18T-gus 的构建
• 2.3.2 酿酒酵母S. cerevisiae 表达载体的构建
• 2.3.3 酿酒酵母S. cerevisiae 基因工程菌的获得
• 2.3.4 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析
• 2.3.5 渗透胁迫对pScGPD1 启动子表达的影响
• 2.4 小结
• 第三章 pScGPD1启动子融合gus报告基因在烟草中的瞬时表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 植物材料
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 工具酶与试剂
• 3.1.5 培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 植物表达载体的构建
• 3.2.2 根癌农杆菌电击转化
• 3.2.3 烟草的遗传转化
• 3.2.4 GUS 瞬时表达活性检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 表达载体p3300-zeocin-pScGPD1-gus 的酶切验证
• 3.3.2 根癌农杆菌的电击转化
• 3.3.3 转基因烟草的选择与再生
• 3.3.4 GUS 瞬时表达检测结果
• 3.4 小结
• 第四章 酵母甘油合成关键酶基因ScGPD1在烟草中的表达研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 植物材料
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 工具酶和试剂
• 4.1.5 培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 植物表达载体的构建
• 4.2.2 根癌农杆菌电击转化
• 4.2.3 烟草的遗传转化
• 4.2.4 转基因烟叶中甘油含量的测定
• 4.2.5 转基因烟叶中GPDH 的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 表达载体p3300-zeocin-ScGPD1 的酶切验证
• 4.3.2 根癌农杆菌的电击转化
• 4.3.3 转基因烟草的获得
• 4.3.4 初始烟叶中甘油的测定
• 4.3.5 初始烟叶中GPDH 的检测
• 4.3.6 不同盐胁迫下烟叶中的甘油含量及GPDH 酶活
• 4.4 小结
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文