呋喃妥因和呋喃唑酮在食品中残留的酶联免疫测定法的研究

论文摘要

随着经济的迅速发展,人民的生活水平不断提高,对肉蛋类产品的需求量大大增加,因而现代的养殖业得到了迅速发展。硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素,因其价格较低且治疗效果好,一些经营者为追求经济利益,而广泛用于畜禽及水产养殖业,并作为治疗药物和饲料添加剂。但是多年来的研究表明,硝基呋喃类药物及其代谢产物具有致癌、致畸、致突变性,这些药物的大量使用不可避免的残留于动物的肉、蛋、奶、脏器、组织中,从而影响人体健康,所以世界上许多国家,比如欧盟、美国、中国、日本等都严格控制硝基呋喃类药物用于畜禽及水产养殖业。因此食品安全问题已引起全世界的高度重视。现在很多国家已经建立了一些药物残留的检测方法。传统检测硝基呋喃类药物残留的分析方法包括HPLC、LC-UV、LC-MS、LC-MS-MS等仪器法。这些方法准确、稳定、可靠,可以作为标准方法,但仪器设备昂贵,样品前处理复杂、费时、费力、不易普及,因此必须建立快速、灵敏、有效的检测方法。酶联免疫检测法（ELISA）克服了以上方法的缺点,是一种快速、灵敏、方便的检测方法,有着广阔的发展前景。因此,本论文旨在建立呋喃妥因和呋喃唑酮及其代谢产物的酶联免疫吸附检测法（ELISA）。对于呋喃妥因及其代谢产物AHD免疫原的制备,根据其结构特点,从其代谢产物（AHD）出发,采用多种方案与载体蛋白偶联,通过免疫只有混合酸酐法合成的免疫原是成功的。它是利用AHD先与CBA偶联引入一羧基,然后利用混合酸酐法与载体蛋白合成了免疫原。合成免疫原的同时,也利用相同的方法合成了多种包被抗原。利用混合酸酐法合成的免疫原免疫新西兰白兔获得了能同时检测呋喃妥因和AHD（以衍生物NPAHD的形式存在）的抗体,得到的抗体分别与多种包被抗原进行交叉测定,结果利用戊二醛法合成的包被抗原进行检测灵敏性及特异性较好。对呋喃妥因抗体其检测结果为:IC50是3.2ng/mL,检测限为0.2 ng/mL。该抗体除对CPAHD和NPAHD的交叉反应率较高外,和其他药物的交叉率均较小。呋喃妥因在养殖用水中的添加回收率批内在90-103%之间,批间在88-103%之间。批内变异系数在2.7-6.2%之间,批间变异系数在3.1-11.4%之间。对AHD抗体其检测结果为:IC50（转化为AHD计算）是10.6 ng/mL,检测限为0.05 ng/mL。该抗体除对CPAHD和呋喃妥因的交叉反应率较高外,和其他药物的交叉率均较小。AHD在猪肝中的添加回收率批内在91-104%之间,批间在80-96%之间。批内变异系数在2.4-17.7%之间,批间变异系数在3.7-14.6%之间。对呋喃唑酮及其代谢产物AOZ的研究,其免疫原和包被抗原的合成方法,与呋喃妥因及其代谢产物的相似,也是从代谢产物AOZ出发,利用多种方案合成了免疫原,通过检测免疫后得到的抗体,用混合酸酐法合成的免疫原免疫得到的抗体,用戊二醛法合成的包被抗原进行检测结果较好,免疫得到的抗体可以同时检测呋喃唑酮及其代谢产物AOZ。对呋喃唑酮的抗体其检测结果为:IC50是2.9 ng/mL,检测限为0.2 ng/mL。该抗体除与CPAOZ和NPAOZ的交叉反应率较高外,和其他药物的交叉率均较小。呋喃唑酮在养殖用水中的添加回收率批内在76-92%之间,批间在74-88%之间。批内变异系数在3.8-14%之间,批间变异系数在3.4-9.2%之间。对AOZ抗体的检测,我们只做了灵敏性及特异性的分析,其检测结果为:IC50（转化为AOZ计算）是3.9 ng/mL,检测限为0.18ng/mL。该抗体除对CPAOZ和呋喃唑酮的交叉反应率较高外,和其他药物的交叉率均较小。通过对硝基呋喃类药物的研究,我们成功地制备了呋喃妥因和呋喃唑酮及其代谢产物的免疫原和包被抗原,并通过动物免疫制备了相应的多克隆抗体,建立了呋喃妥因和呋喃唑酮及其代谢产物的酶联免疫检测法,并用于实际体系检测,检测结果显示该方法的重复性、精确度、准确度较好。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 前言
• 第一章 硝基呋喃类药物概述
• 第二章 硝基呋喃类药物检测方法
• 第一节 仪器法
• 2.1.1 高效液相色谱法（HPLC）
• 2.1.2 液相-质谱联用法（LC-MS）
• 第二节 生物免疫检测法
• 2.2.1 酶联免疫吸附测定法（ELISA）基本原理
• 2.2.2 ELISA的特点
• 2.2.3 ELISA的检测类型
• 2.2.4 免疫原的制备
• 2.2.4.1 载体的选择
• 2.2.4.2 免疫原连接方法
• 2.2.4.3 免疫原的鉴定方法
• 2.2.5 硝基呋喃类药物酶联免疫检测的研究现状
• 2.2.6 本论文设计目的和思路
• 第二部分 实验部分
• 第一章 实验材料
• 第一节 实验材料与设备
• 1.1.1 实验试剂及实验耗材
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 主要缓冲溶液的配制
• 第二章 偶联物的制备
• 第一节 呋喃妥因及其代谢产物的偶联物的制备
• 2.1.1 活化牛血清白蛋白（cBSA）的制备
• 2.1.2 AHD衍生物的制备
• 2.1.3 呋喃妥因及其代谢产物（AHD）免疫原的合成
• 2.1.4 呋喃妥因及其代谢产物（AHD）包被抗原的合成
• 第二节 呋喃唑酮及其代谢产物的偶联物的制备
• 2.2.1 AOZ衍生物的制备
• 2.2.2 呋喃唑酮及其代谢产物（AOZ）免疫原的合成
• 2.2.3 呋喃唑酮及其代谢产物（AOZ）包被抗原的合成
• 第三章 呋喃妥因和呋喃唑酮及其代谢产物多克隆抗体的制备
• 第一节 抗体的制备过程
• 3.1.1 免疫方案
• 3.1.2 心脏采血
• 3.1.3 抗体的纯化与保存
• 第四章 抗体检测
• 第一节 呋喃妥因及其代谢产物（AHD）多克隆抗体的检测
• 4.1.1 呋喃妥因和AHD多克隆抗体最佳测定浓度的选择
• 4.1.2 间接酶联免疫吸附测定法测定呋喃妥因和AHD抗体效价
• 4.1.3 竞争酶联免疫吸附测定法测定呋喃妥因和AHD抗体灵敏性
• 4.1.4 呋喃妥因和AHD抗体交叉反应率（特异性）的测定
• 4.1.5 呋喃妥因回收率的检测
• 4.1.5.1 标准曲线的建立
• 4.1.5.2 水体系中呋喃妥因残留量的检测
• 4.1.6 AHD回收率的检测
• 4.1.6.1 标准曲线的建立
• 4.1.6.2 生物基质的影响
• 4.1.6.3 NPAHD的衍生
• 4.1.6.4 回收率和变异系数的测定
• 第二节 呋喃唑酮及其代谢产物（AOZ）多克隆抗体的检测
• 4.2.1 呋喃唑酮和AOZ多克隆抗体最佳测定浓度的选择
• 4.2.2 间接ELISA法测定呋喃唑酮和AOZ多克隆抗体抗体效价
• 4.2.3 竞争ELISA法测定呋喃唑酮和AOZ抗体灵敏性
• 4.2.4 呋喃唑酮和AOZ抗体交叉反应率（特异性）的测定
• 4.2.5 呋喃唑酮回收率的检测
• 4.2.5.1 标准曲线的建立
• 4.2.5.2 水体系中呋喃唑酮残留量的检测
• 第三部分 结果与讨论
• 第一章 免疫原的合成与鉴定
• 第一节 呋喃妥因和AHD免疫原的合成与鉴定
• 1.1.1 载体蛋白的选择
• 1.1.2 呋喃妥因和AHD免疫原的合成与鉴定
• 第二节 呋喃唑酮和AOZ免疫原的合成与鉴定
• 第二章 抗体的制备过程
• 第一节 免疫方案
• 2.1.1 免疫动物
• 2.1.2 免疫过程
• 2.1.3 佐剂的应用
• 第二节 抗血清的制备与冻存
• 2.2.1 采血方法
• 2.2.2 器械灭菌
• 2.2.3 饱和硫酸铵纯化
• 2.2.4 抗血清的冻存
• 第三章 抗体的检测
• 第一节 影响ELISA检测的因素
• 第二节 呋喃妥因抗体的检测结果与分析
• 3.2.1 呋喃妥因抗体的效价测定
• 3.2.2 呋喃妥因抗体的间接竞争ELISA的检测
• 3.2.3 呋喃妥因抗体交叉反应率的测定
• 3.2.4 呋喃妥因抗体回收率的测定
• 第三节 AHD抗体的检测结果与分析
• 3.3.1 AHD抗体的效价测定
• 3.3.2 AHD抗体的间接竞争ELISA的检测
• 3.3.3 AHD抗体交叉反应率的测定
• 3.3.4 AHD抗体回收率的测定
• 3.3.4.1 标准曲线的建立
• 3.3.4.2 NPAHD的衍生及生物基质的影响
• 3.3.4.3 回收率和变异系数的测定
• 第四节 呋喃唑酮抗体的检测结果与分析
• 3.4.1 呋喃唑酮抗体的效价测定
• 3.4.2 呋喃唑酮抗体的间接竞争ELISA的检测
• 3.4.3 呋喃唑酮抗体交叉反应率的测定
• 3.4.4 呋喃唑酮抗体回收率的测定
• 第五节 AOZ抗体的检测结果与分析
• 3.5.1 AOZ抗体的效价测定
• 3.5.2 AOZ抗体的间接竞争ELISA的检测
• 3.5.3 AOZ抗体交叉反应率的测定
• 第四章 结论
• 附图
• 参考文献
• 本人发表的文章和专利
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表