罗格列酮对2型糖尿病小鼠肌肉萎缩拮抗机制

论文摘要

目的了解单纯性2型糖尿病（胰岛素抵抗）是否会出现肌肉萎缩,探讨导致2型糖尿病肌肉萎缩的机制。方法1.动物采用2型糖尿病基因模型小鼠（BKS.Cg-m+/Lepr）作为实验组,同窝出生的野生型小鼠为对照组（C57BLKS/J<m+/m+>）,每组12只雄性小鼠,均为出生四周,实验组和对照组小鼠均购自Jackson Laboratories（Bar Harbor,ME USA）。对四周大小的实验组和对照组小鼠进行称重,然后均以12h亮、12h暗的周期饲养。在另一组试验中,一组对照组和实验组均饲以标准饲料,另一组在对照组和实验组饲料中均加入马来酸罗格列酮饲养（8mg/kg/d）.2.在第9周时再对两组小鼠进行称重、测量身长,并采用从心脏采血的方法采集血样,分别测定实验组和对照组小鼠的血浆胰岛素和血糖。之后将实验组和对照组小鼠麻醉,取比目鱼肌、伸趾长肌、跖肌和心肌进行称重,并分别测定两组小鼠肌肉蛋白质降解速率、肌动蛋白降解片段、肌纤维横断面面积以及蛋白酶体活性。3.细胞培养将小鼠3T3-L1前脂肪细胞3-10代的细胞置37℃.5% CO2的培养箱中培养,期间依次采用标准DMEM（Invitrogen,Carlsbad,CA）培养基,含10%小牛血清（HyClone,Logan,UT）、青霉素（200U/m1）和链霉素（200Ｌμg/ml）,培养2天；依次放在含1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素和0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（Sigma-Aldrich）的诱导分化细胞培养基中培养2天；放在含10%胰岛素的分化后培养基中生长5天,这时细胞形态上呈现高分化型。之后,细胞再次于DMEM培养基中继续培养2天。接下来,将细胞放在含10μg/ml罗格列酮（Cayman Chemical,Ann Arbor,MI）培养基中培养16小时,然后收集细胞,检测各项指标,包括：脂联素mRNA、肿瘤坏死因子a（TNF-a）和白介素6（IL-6）的mRNA表达水平。4. Real-time PCR用TrizolRNA提取试齐（？）（Invitrogen）从对照组和实验组小鼠腓肠肌和不同分化形态的3T3-L1小鼠细胞提取RNA,进行反转录后。Real-time PCR用SYBR GreenPCR试剂（Bio-Rad,Hercules,CA）、the Opticon DNA仪器（Bio-Rad）和下面的循环参数：94℃2分钟,94℃15秒40个循环,55℃30秒,72℃30秒,最后72℃10分钟。加入引物小鼠泛素连接酶、MuRF-1、甘油醛-3磷酸脱氢酶进行扩增,测定GAPDH基因和检出值mRNA的表达之间的差异。5.统计分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析,服从正态分布的数据以均数±标准差（x±s）表示,不同处理组间均数的比较采用单因素方差分析（ANOVA）,两组之间比较用t检验,以P<0.05作为有统计学意义的判断标准。结果1.在实验第4周时实验组小鼠体重与对照组小鼠体重没有明显差别（n=12,t=1.263,P>0.05）；但在第9周时实验组小鼠体重、血糖、血浆胰岛素水平与对照组小鼠比较均有明显增加且差别具有统计学意义（分别为t=20.320, P < 0.0001;t=14.294,P< 0.001;t=31.004, P< 0.0001）。二者之间BMI差异有显著性（t=5.362,P<0.001）。2.在第9周时实验组小鼠比目鱼肌、伸趾长肌、跖肌肌肉重量与对照组相比均有明显下降且差异具有显著性意义（n=9,t=2.961,P<0.05）。3.实验组小鼠腓肠肌肌纤维横切面面积显著小于对照组且差异具有显著性意义（n=9,t=33.732,P<0.001）。4.实验组小鼠腓肠肌14-Kda的肌动蛋白片段密度显著高于对照组（n=9,t=3.013,P<0.05）。5.实验组小鼠比目鱼肌、伸趾长肌、跖肌的蛋白质降解速率显著高于对照组（n=9,t=3.743,P<0.05）。6.实验组小鼠腓肠肌中的蛋白体酶活性显著高于对照组（n=6,t=4.521,P<0.05）。7.2型糖尿小鼠磷脂酰肌醇-3激酶（PI3 Kinase）活性显著降低（n=9,t=2.916,P<0.05）,同时胰岛素受体1磷酸化丝氨酸307激酶（pIRS1-ser307）活性显著升高（n=9,t=21.251,P< 0.0001）, Akt磷酸化丝氨酸473 （pIRS1-ser473）活性降低,与对照组相比具有统计学意义（n=9,t=4.812,P<0.001）。8.2型糖尿病小鼠和野生型小鼠均加喂马来酸罗格列酮饲养35天后,2型糖尿病小鼠血糖、血浆胰岛素水平均下降到野生型水平,高血糖症、高胰岛素血症均得到纠正；但其体重没有明显变化。9.2型糖尿小鼠和野生型小鼠均加喂马来酸罗格列酮饲养35天后,2型糖尿小鼠与未加喂罗格列酮的2型糖尿小鼠相比：糖皮质激素皮质酮的含量显著降低（n=4,t=36.937P<0.0001）；二者相比,血浆脂联素水平明显升高（n=4,t=4.442,P<0.05）。10.2型糖尿病小鼠和野生型小鼠均加喂马来酸罗格列酮饲养35天后,PI3K活性增加（t=3,635,P<0.05;n=4）;IRS-1磷酸化的丝氨酸307（pIRS1-ser307）活性降低（t=2,93,P<0.05; n=6）、Akt磷酸化的丝氨酸473 （pAkt-ser473）活性升高（t=3,115P<0.05；n=6）11.实验组和对照组均加喂罗格列酮饲养35天后,加喂罗格列酮饲养35天后的2型糖尿小鼠蛋白酶体活性与未喂加罗格列酮饲养的2型糖尿小鼠相比显著降低（n=4,t=6.609,P<0.005）；加喂罗格列酮饲养35天后2型糖尿小鼠目鱼肌、伸趾长肌、跖肌蛋白质分解速率较未加喂罗格列酮均显著降低(（n=4,t=2.461,P<0.05（比目鱼肌）；t=4.401,P<0.05（伸趾长肌）；t=2.718,P<0.05（跖肌））。12.细胞培养结果显示,培养基中加罗格列酮后,脂联素mRNA表达水平增加,同时肿瘤坏死因子a（TNF-a）和白介素6（IL-6）的mRNA表达水平降低。13.实验组和对照组均加喂罗格列酮饲养35天后,加喂罗格列酮饲养后的2型糖尿小鼠蛋白酶体活性磷脂酰肌醇-3激酶活性升高,且有统计学意义（n=4,t=3.635,P<0.05）；肌肉中FOXO1转录因子水平降低、FOXO1转录因子磷酸化水平升高,肌肉中磷酸化FOXO1转录因子与FOXO1转录因子比值升高（n=4,t=4.213,P<0.05）；肌肉萎缩因子（n=4,t=3.428,P<0.05）、肌肉环状指基因1mRNA表达水平下降（n=4,t=2.987,P<0.0001）。结论1.2型糖尿病小鼠肌肉蛋白质降解增加,存在严重的肌肉萎缩。2.2型糖尿病小鼠泛素-蛋白酶体蛋白质水解途径的被激活,从而使蛋白质降解增加,可能是导致肌肉萎缩的机制之一,尚有待进一步深入探讨。3.2型糖尿病小鼠PI3K/Akt细胞通路受损,引起胰岛素抵抗,也可能是导致肌肉萎缩的机制之一。4.罗格列酮可以提高2型糖尿病小鼠对胰岛素的敏感性,纠正高血糖、高胰岛素症,脂酰肌醇-3激酶活升高,蛋白酶体活性降低、降低肌肉萎缩因子、肌肉环状指基因1mRNA表达水平,拮抗2型糖尿病小鼠骨骼肌肌肉萎缩。

论文目录

• 摘要
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• 结果
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• 结论
• 参考文献
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