梅花鹿鹿茸角柄骨膜不同部位差异蛋白的筛选

论文摘要

鹿茸是唯一能完全再生的哺乳动物器官,可以作为一种绝佳的生物医学模型来探索哺乳动物组织或器官再生之谜。进一步研究发现,鹿茸再生是从角柄上发生的,是基于干细胞的过程,该过程取决于角柄远端骨膜干细胞受到周期性的激活。以往的研究多从形态学、组织学以及基因功能方面对鹿茸再生进行研究,而从蛋白质方面进行的研究很少。为此,本论文以梅花鹿鹿茸角柄骨膜为实验材料,利用双向电泳技术、质谱及生物信息学技术从蛋白质组学方面对角柄骨膜不同部位的差异蛋白进行研究,为进一步阐述鹿茸再生机制奠定理论基础。1、本实验首先优化了角柄骨膜组织的破碎方法,对角柄骨膜蛋白的提取方法及双向电泳分析的参数设置进行了摸索,建立了适于角柄骨膜蛋白质分析的双向电泳体系。结果显示:（1）将骨膜组织剪切成2mm×2mm大小的碎块,然后液氮预冷,当液氮刚好覆盖样品时进行研磨,此方法可充分破碎骨膜组织。（2）裂解液配方为7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、65mM DTT、1mM PMSF和0.2% Bio-lyte,此裂解液可充分获得角柄骨膜蛋白是适于双向电泳分析的样品制备方法。2、利用建立的双向电泳体系,对角柄骨膜不同部位的蛋白质进行了比较分析,检测到了不同部位2-DE图谱的差异蛋白点,并利用质谱鉴定和生物信息学技术,对这些蛋白点进行鉴定,分类。结果显示:（1）角柄骨膜不同部位蛋白质2-DE图谱中蛋白斑点数量致敏区（分别为269、311）多于休眠区（分别为241、241）,不同部位蛋白斑点的匹配率达50%左右。（2）初步蛋白斑点的质谱鉴定结果表明,共鉴定出47个蛋白,鉴定的蛋白按照功能可分为两个大类,一类是活性蛋白,共42个,占鉴定蛋白的89.36%;一类是非活性蛋白,共5个,占鉴定蛋白的10.64%。其中活性蛋白按照其功能不同又可分为五大类,其中起催化功能的酶类共14个,占鉴定蛋白的29.79%;控制生长及分化的蛋白质共13个,占鉴定蛋白的27.66%;运输及贮存蛋白共8个,占鉴定蛋白的17.02%;运动蛋白质共3个,占鉴定蛋白的6.38%;防御蛋白质共4个,占鉴定蛋白的8.51%。3、对鉴定的蛋白进行功能分析,发现在已鉴定蛋白中,PKM2、MAPK1、pigment epithelium-derived factor、peroxiredoxin 4、heat shock 90kDa protein 1, alpha、fibulin 5等六种蛋白与鹿茸再生密切相关,可能参与了鹿茸再生的相关信号转导与分子调控。其中pigment epithelium-derived factor和fibulin 5具有抑制血管生成的功效,在角柄骨膜启动鹿茸再生过程中,调节这两类蛋白的表达,可能是调控鹿茸的快速生长而不发生癌变的方式之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 研究背景
• 1.2.1 鹿茸再生
• 1.2.2 鹿茸再生的组织学基础
• 1.2.3 角柄骨膜
• 1.3 蛋白质组学
• 1.3.1 蛋白质组学的产生背景
• 1.3.2 蛋白质组学的研究内容及研究策略
• 1.3.3 双向凝胶电泳
• 1.4 研究内容
• 1.4.1 梅花鹿鹿茸角柄骨膜蛋白质组学研究进展
• 1.4.2 本论文的研究内容
• 第2章 角柄骨膜蛋白质双向电泳体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 组织破碎
• 2.2.2 蛋白质提取及预处理
• 2.2.3 蛋白质浓度测定
• 2.2.4 双向电泳图谱比较
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 第3章 角柄骨膜不同部位差异蛋白的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验动物
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 实验方法
• 3.1.5 图像分析
• 3.1.6 质谱鉴定
• 3.1.7 蛋白数据库检索
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 角柄骨膜不同部位蛋白质含量的测定
• 3.2.2 角柄骨膜不同部位蛋白质双向电泳图谱比较
• 3.2.3 角柄骨膜不同部位差异蛋白的质谱鉴定
• 3.2.4 部分质谱鉴定蛋白的功能分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 质谱鉴定
• 3.3.2 角柄骨膜上部蛋白质与鹿茸再生
• 3.4 本章小结
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 大摘要