沙门菌PCR检测方法的建立及其初步应用

论文摘要

沙门菌（Salmonella）是一种重要的食源性病原菌,可引起人和动物肠胃炎、伤寒、菌血症、肠道之外定殖感染（骨髓炎,血管内的感染或是病灶性脓肿）、Reiter’s综合症等多种疾病。人和动物常因摄入被沙门菌污染的食物、水,或是与患者接触而感染。目前许多发达国家已建立起完善的监测和控制体系,并对该菌进行了较为深入的研究。本研究的目的是:（1）建立沙门菌PCR检测新方法;（2）使用不同类型的样品评价PCR方法;（3）对本研究获得的分离株应用2007年美国临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐使用的琼脂扩散法进行耐药分析。一、沙门菌PCR检测方法的建立以沙门菌肠毒素stn基因作为靶基因,建立沙门菌的PCR检测方法。对沙门菌属A—F群17株沙门菌进行特异性检测,17株沙门菌经PCR扩增,在260 bp处分别出现属特异性条带,说明该方法无假阴性。对埃希氏菌属的大肠杆菌标准株（ATCC 25922）、肠出血性大肠杆菌EHEC、肠致病性大肠杆菌EPEC、肠侵袭性大肠杆菌ETEC,克雷伯氏菌属的肺炎克雷伯杆菌,志贺氏菌属痢疾杆菌、福氏2a志贺氏菌,变形杆菌属的普通变形杆菌、奇异变形杆菌,柠檬酸杆菌属的弗氏柠檬酸杆菌,肠杆菌属的阴沟肠杆菌,普罗威登菌属的普罗威登斯菌,假单胞菌属的铜绿假单胞菌,粪链球菌,葡萄球菌,蜡样芽孢杆菌,乳酸杆菌共17种非沙门菌进行了特异性检测,均无特异性条带出现。这表明该PCR方法具有良好的特异性。该方法可以直接检出人工污染的样品,可检测到43.85pg沙门菌DNA,增菌后PCR最低检测限为1CFU。综上所述,本研究建立了沙门菌的PCR检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性,适合沙门菌的检测,为沙门菌监测提供了新方法。二、PCR方法的初步应用在2008年7月-2009年1月,随机采集禽源的肛拭、肝脏病料和鸡蛋样品共1082份,猪源的肛拭、肉类和淋巴结样品共466份,扬州地区环境和游泳池水样共58份。用PCR方法检测这三种来源的样品,并进行沙门菌的分离。结果显示:1082份禽源样品检出41份阳性,466份猪源样品检出15份阳性,58份水源样品检出2份阳性,共获得58株分离株,经国标方法验证为沙门菌。通过大量样本验证了本研究建立的PCR方法适用于禽源、猪源、水源样品的检测,而且适用于不同类型的样品检测如:肛拭、肝脏、水样、肉类样品等。三、沙门菌分离株的耐药性分析采用2007年美国临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐使用的琼脂扩散法对100株沙门菌的耐药性进行了研究。药敏结果显示,沙门菌的耐药性较高,而且多重耐药状况不容乐观。结果表明,100株沙门菌对头孢类抗生素敏感,但是对萘啶酸、四环素和链霉素产生了较强的耐药性。耐药谱的分析结果显示,100株分离株的多重耐药主要集中在2耐到5耐和13耐,占78.13%。这些数据表明,在我国,沙门菌的多重耐药的现象十分严重,耐药谱也比较宽,有4株沙门菌分离株对13种抗生素同时产生了耐药性。本研究中不同样品来源的分离株对不同种类抗生素的敏感性存在一定的差异,因此在临床上应用抗生素防治沙门菌病时,必须结合药敏试验结果选择高敏药物或配合用药,并且做到定期更换药物、合理用药才能起到预期的效果。多重耐药沙门菌的出现应引起重视,这些细菌将对人群的健康构成严重的威胁,因此,在医学和兽医学临床,都必须谨慎和科学使用抗生素药物。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 概述
• 2. 沙门菌――食源性病原菌
• 2.1 分类及命名
• 2.2 病原学
• 2.3 流行病学
• 2.4 沙门菌的危害
• 3. 沙门菌在禽，猪和水中的污染状况
• 3.1 禽及蛋类
• 3.2 猪
• 3.3 水环境
• 4. 沙门菌检测技术
• 4.1 常规分离鉴定方法
• 4.2 免疫学检测方法
• 4.2.1 直接 ELISA 方法
• 4.2.2 斑点印迹ELISA 方法
• 4.3 核酸检测技术
• 5. 沙门菌耐药性概述
• 6. 结语
• 7. 参考文献
• 第二章 沙门菌 PCR 检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 序列比对结果
• 2.2 特异性试验结果
• 2.3 敏感性试验结果
• 2.4 模拟污染试验
• 3 讨论
• 4. 参考文献
• 第三章 PCR 方法的初步应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 禽源样品及禽源分离株检测结果
• 2.2 猪源样品及猪源分离株检测结果
• 2.3 水源样品及人源分离株检测结果
• 3 讨论
• 4. 参考文献
• 第四章 沙门菌分离株的耐药性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 耐药性分析
• 2.2 耐药谱分析
• 3. 讨论
• 4. 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文