人GRP78 miRNA载体的构建及其对EC109细胞增殖的影响

论文摘要

研究目的:构建人GRP78 miRNA表达载体,筛选出最佳干扰效果的干扰载体,转染EC109细胞,探讨其对EC109细胞增殖的影响。材料和方法:1、根据miRNA干扰原理,设计合成4对针对人GRP78的特异性miRNA干扰序列,连接到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表达载体,分别命名为miR78-1、miR78-2、miR78-3、miR78-4,并通过测序鉴定。2、把测序正确的干扰质粒利用脂质体Lipofectamine 2000转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况以检测转染效率,通过杀稻瘟菌素筛选2周左右,得到稳定表达干扰质粒的细胞株,通过RT-PCR检测稳定筛选后HEK293细胞中GRP78 mRNA的表达水平。3、将最佳干扰效果的干扰质粒瞬时转染EC109细胞,通过RT-PCR检测转染24h后GRP78 mRNA的表达水平,利用CCK8检测转染干扰质粒0h、12h、24h、48h、72 h后EC109细胞的增殖情况。结果:1、DNA测序表明重组质粒中含有目的片段,且插入片段的碱基序列完整,没有碱基的突变以及丢失。2、建立了稳定表达干扰质粒的HEK293细胞株,稳定转染后HEK293细胞在荧光显微镜下观察均有绿色荧光蛋白表达。与阴性对照组、未转染组比较,在干扰组细胞中GRP78 mRNA的表达有不同程度的下降（P<0.05）,其中转染miR78-1组GRP78 mRNA的表达下降最明显（P<0.05）。3、miR78-1干扰质粒瞬时转染EC109细胞后,与未转染组、阴性对照组相比,细胞中GRP78 mRNA的表达下降（P<0.05）;CCK8检测结果表明转染miR78-1干扰质粒12, 24, 48, 72 h后,EC109细胞的增殖减慢（P<0.05）。结论:1、设计的4对干扰序列正确完整地克隆到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中,GRP78 miRNA表达载体构建成功。2、成功建立了GRP78基因“敲弱”的HEK293细胞模型,筛选出miR78-1为最佳干扰效果的干扰载体。3、miR78-1干扰质粒瞬时转染EC109细胞后,能抑制EC109细胞中GRP78 mRNA的表达,能抑制EC109细胞的生长。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词简表
• 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 本研究课题的基金来源
• 第一部分 人GRP78 miRNA 载体的构建及筛选鉴定
• 第一章 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 第二章 结果与分析
• 2.1 干扰质粒测序结果
• 2.2 荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP 的表达情况
• 2.3 稳定转染细胞中GRP78 mRNA 的表达情况
• 第三章 讨论
• 第二部分 人GRP78 miRNA 载体对EC109 细胞增殖的影响
• 第一章 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 第二章 结果及分析
• 2.1 EGFP 的表达情况
• 2.2 GRP78 mRNA 表达水平改变
• 2.3 CCK8 检测转染细胞增殖变化
• 第三章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录（试剂配制）
• 致谢
• 个人简介