猴头菌子实体多糖的分离纯化、结构鉴定、结构修饰和生物活性研究

论文摘要

猴头菌（Hericium erinaceus），是一种名贵的食用和药用真菌，具有利五脏、助消化、滋补和抗癌功效，主要用于治疗消化不良、胃溃疡、胃癌、十二指肠癌、贲门癌等消化系统的疾病和肿瘤。其子实体和菌丝体均含有活性多糖。文献报道，猴头菌多糖具有增强免疫功能、抑制肿瘤、降血糖、延缓衰老等作用。由于目前对猴头菌多糖的研究侧重于粗多糖，对其中均一多糖组分的详细化学结构报道较少，为系统地研究猴头菌多糖的化学结构和生物活性，我们对猴头菌子实体中的各种多糖组分进行了分离纯化、结构鉴定及药理活性研究。本文共有四个部分，分别从多糖的理化性质、糖组成、结构分析、结构修饰和生物活性进行研究。目前取得的成果如下：1猴头菌子实体多糖分离纯化及理化性质研究猴头菌子实体经热水提取，乙醇沉淀，得粗多糖，然后粗多糖经阴离子交换层析（DEAE Sepharose F．F．）和凝胶柱（Sephacryl S系列材料）层析获得五个组分HEPF1-HEPF5。紫外全扫描不含蛋白质和核酸，红外光谱检测都含有糖的特征性基团，通过高效液相色谱检测为均一组分，其分子量分别为1.94×104Da、1.66×104Da、1.90×104Da、2.03×104Da和4.23×105Da。2猴头菌子实体多糖的结构研究本章通过单糖组成分析、甲基化分析、部分酸水解、核磁共振(一维：1H NMR，13C NMR，二维：1H-1H COSY谱、TOCSY谱、HMQC谱、NOESY谱和HMBC谱)技术，对糖组成、糖残基的个数、糖残基的连接方式、构型、连接顺序等进行了研究。1．HEPF1的结构分析糖组成分析结果表明HEPF1含有岩藻糖、半乳糖、葡萄糖以1.00∶4.03∶1.04组成，并且还含有少量的3-O-甲基-鼠李糖。甲基化分析结果表明，3-O-甲基-鼠李糖和岩藻糖主要以端基的形式存在，半乳糖主要为1，6、1，2，6两种连接方式存在。葡萄糖主要以1，6连接的，还有少量的1，3，6和端基形式存在。核磁共振分析表明HPEF1的结构应该是以α-D-1，6连接的半乳糖构成主链，侧链为α构型的端基岩藻糖和β-D-1，6的葡萄糖为侧链的杂多糖，另外糖链中还含有少量的端基3-0-甲基鼠李糖和葡萄糖，它的可能结构为：2．HEPF2的结构分析糖组成分析结果表明HEPF2含有岩藻糖、半乳糖、葡萄糖以1.00：3.69：4.52组成，并且还含有少量的3-0-甲基-鼠李糖。HEPF2甲基化分析结果表明，葡萄糖残基主要以1，4、1，6连接存在，同时还含有少量的末端残基；半乳糖主要为1，6、1，2，6两种连接方式和少量的端基末端；岩藻糖主要以端基的形式存在，同时还含有少量的以端基形式存在的3-0-鼠李糖。通过部分酸水解和核磁共振分析可知，HEPF2的可能结构为主链由β构型存在的1，4葡萄糖、1，6连接的葡萄糖、α构型存在的1，6和1，2，6半乳糖组成，侧链分支为1，2，6半乳糖，端基葡萄糖、端基半乳糖和端基岩藻糖，其中端基α构型的岩藻糖连接在1，2，6半乳糖的2位处。3．HEPF3的结构分析糖组成分析结果表明HEPF3含有岩藻糖、半乳糖以1.00：4.12组成，并且还含有少量的3-0-甲基-鼠李糖。HEPF3甲基化分析结果表明，3-O-甲基鼠李糖和岩藻糖的连接方式以端基连接。半乳糖主要为1，6、1，2，6两种连接方式。此结果表明HEPF3分枝点主要位于半乳糖上。三者主要连接的摩尔比为1：2.94：1.2。由核磁共振进一步分析，HEPF3是以α-1，6半乳糖为主链的，α-岩藻糖为侧链的五个单糖残基组成的重复结构单元，并且还含有少量的端基3-O-甲基鼠李糖，具体结构为：4．HEPF4的结构分析糖组成分析结果表明HEPF4含有岩藻糖、半乳糖和葡萄糖以1.00：3.27：0.28组成，并且还含有少量的3-0-甲基-鼠李糖。HEPF4甲基化分析结果表明，少量的3-O-甲基鼠李糖、葡萄糖和岩藻糖的连接方式以端基连接，半乳糖主要为1，6、1，2，6两种连接方式。此结果表明HEPF4分枝点主要位于半乳糖上。三者主要连接的摩尔比为1：2.12：1.07。由核磁共振进一步分析，HEPF4是以α-1，6半乳糖为主链的，α-岩藻糖为侧链的四个单糖残基组成的重复结构单元的并且还含有少量的端基葡萄糖和3-O-甲基鼠李糖，其具体结构为：5．HEPF5的结构分析糖组成分析结果表明HEPF5仅由葡萄糖组成。HEPF5甲基化分析结果表明，葡萄糖的连接方式以端基和1，3，4两种连接方式。二者主要连接的摩尔比为1：2.82。说明HEPF5是4个单糖残基的重复单元结构。由核磁共振进一步分析，它是由HEPF5是一个由葡萄糖组成的，多分支的一种葡聚糖，其具体结构为：3硫酸酯化猴头菌多糖的结构与构象研究利用碱提醇沉法从猴头菌（Hericium erinaceus）子实体中获得碱提水不溶性多糖HEPFA，氯磺酸-吡啶法对HEPFA进行硫酸化修饰后，制得能溶于水的硫酸化猴头菌多糖。通过DEAE-Sepharose F. F.离子交换柱层析和Sephacryl S-500凝胶柱层析得到一种相对分子量为5.38×105 Da，硫酸基含量为19.5％的硫酸酯化的猴头菌多糖（S-HEPFA）。S-HEPFA的红外光谱分析表明，在波数1236 cm-1、820 cm-1处有硫酸酯键的特征吸收峰；经离子色谱检测，该组分只含有葡萄糖，甲基化分析得组成S-HEPFA糖链主要的葡萄糖残基由1-连接Glcp、1，3-连接Glcp和1，3，6-连接Glcp组成，摩尔比为2.07：1：1.83。刚果红实验分析得S-HEPFA在水溶液中或微碱溶液中为三股螺旋构象。4猴头菌子实体多糖的生物活性对五种不同方式得到的猴头菌提取物（醇提物、全水提物、HEPF30、HEPF60、HEPF85）对乙醇致大鼠胃黏膜损伤的治疗进行研究，结果表明以等量的原生药量计时，猴头菌全水提物疗效最明显，其他组分（醇提物、HEPF30、HEPF60、HEPF85、阳性对照、阴性对照）的溃疡抑制率分别是47.1％、52.62％、56.40％、54.36％、43.93％、24.94％。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语
• 第一章 文献综述
• 第一节 猴头菌的研究概况
• 1 猴头菌的生物学研究概况
• 2 猴头菌的化学成分
• 3 猴头菌的营养价值
• 4 猴头菌的药理作用
• 5 临床应用研究
• 6 小结
• 第二节 食药用菌多糖的提取、分离纯化与结构分析
• 1 食药用菌多糖的提取、分离纯化与纯度检测
• 1.1 食药用菌多糖的提取
• 1.2 食药用菌多糖的分离纯化与纯度检测
• 2 食药用菌多糖的结构分析
• 2.1 化学方法
• 2.1.1 水解法
• 2.1.2 高碘酸氧化法
• 2.1.3 Smith降解
• 2.1.4 甲基化反应
• 2.2 波谱学方法
• 2.2.1 紫外光谱法
• 2.2.2 红外光谱法
• 2.2.3 质谱法
• 2.2.4 核磁共振波谱法
• 2.2.4.1 溶剂和温度
• 2.2.4.2 核磁共振谱的分类
• 2.2.4.3 核磁共振波谱在多糖解析中的综合应用
• 第三节 本研究的意义、研究内容和预期目标
• 1 研究意义
• 2 研究内容
• 3 预期目标
• 第二章 猴头菌子实体多糖分离纯化及理化性质研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 猴头菌子实体多糖的提取分离
• 1.3 猴头菌子实体提取物中多糖含量的测定
• 1.3.1 提取物中的还原糖的测定
• 1.3.2 提取物中总糖的测定
• 1.3.3 提取物中多糖的含量
• 1.4 提取物的分离纯化
• 1.4.1 粗多糖的离子柱层析
• 1.4.2 多糖的凝胶柱层析
• 1.5 多糖的纯度的鉴定
• 1.6 多糖的分子量的测定
• 1.7 紫外光谱（UV）的检测
• 1.8 红外光谱（IR）分析
• 2 结果与分析
• 2.1 猴头菌子实体粗多糖的提取分离
• 2.2 猴头菌子实体提取物中多糖含量的测定
• 2.3 多糖的分离纯化
• 2.4 多糖的凝胶柱层析
• 2.5 样品纯度的鉴定
• 2.6 样品分子量的测定
• 2.7 样品的紫外分析
• 2.8 样品的红外光谱分析
• 3 讨论
• 第三章 猴头菌子实体多糖的结构研究
• 第一节 猴头菌子实体多糖单糖组成研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 HPEF1单糖残基的定性分析
• 1.3 HEPF1单糖残基的定量分析
• 1.3.1 HEPF1的气相色谱法
• 1.3.2 高效阴离子色谱法
• 1.3.3 气质联用分析
• 1.3.4 甲基化分析
• 1.3.5 HEPF2,HEPF3,HEPF4,HEPF5的单糖组成分析
• 2 结果与分析
• 2.1 HEPF1的单糖残基的定性分析
• 2.2 HEPF1的单糖残基的定量分析
• 2.2.1 HEPF1的单糖残基比例的气相色谱（GC）分析
• 2.2.2 HEPF1的离子色谱分析
• 2.2.3 HEPF1的气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析
• 2.2.4 甲基化分析
• 2.2.5 HEPF2-HEPF5的单糖组成分析
• 3 讨论
• 第二节 猴头菌子实体多糖的结构鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 糖残基连接方式分析
• 1.3 HEPF2的部分酸水解
• 1.4 核磁共振分析
• 2 结果与分析
• 2.1 HEPF1的结构解析
• 2.1.1 糖残基连接方式分析
• 2.1.2 HEPF1核磁共振分析
• 2.2 HEPF2的结构分析
• 2.2.1 糖残基连接方式分析
• 2.2.2 部分酸水解分析
• 2.2.3 核磁共振分析
• 2.3 HEPF3的结构分析
• 2.3.1 糖残基连接方式分析
• 2.3.2 核磁共振分析
• 2.4 HEPF4的结构分析
• 2.4.1 糖残基连接方式分析
• 2.4.2 核磁共振分析
• 2.5 HEPF5的结构分析
• 2.5.1 糖残基连接方式分析
• 2.5.2 核磁共振分析
• 3 结论
• 第四章 硫酸酯化猴头菌多糖的结构与构象研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 硫酸酯化猴头菌多糖的制备和分析
• 1.2.1 粗多糖HEPFA的提取
• 1.2.2 碱提水不溶性多糖硫酸化的制备
• 1.3 纯度及相对分子量的测定
• 1.3.1 采用高效液相色谱法
• 1.3.2 分子量的测定
• 1.4 理化性质测定
• 1.4.1 多糖测定
• 1.4.2 硫酸基含量的测定
• 1.5 单糖组成分析
• 1.6 光谱学鉴定
• 1.7 S-HEPFA的甲基化分析
• 1.8 刚果红实验
• 2 结果与分析
• 2.1 S-HEPFA的分离纯化结果
• 2.2 S-HEPFA的酯化条件及结果
• 2.3 糖组成分析
• 2.4 S-HEPFA的光谱学鉴定结果
• 2.5 甲基化分析
• 2.6 刚果红实验
• 3 结论
• 第五章 猴头菌子实体多糖的生物活性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 全文总结
• 附录
• 附录一 实验仪器和试剂
• 附录二 相关实验图片
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录