落叶松体细胞胚全长cDNA文库构建及转录组研究

论文摘要

体细胞胚胎发生是林木无性系及新品种规模化繁殖的主要手段,也是研究植物细胞全能性的理想模式体系,在林木的品种改良、规模化繁殖、种质保存及遗传转化等诸多领域均有重要科学意义和应用价值。然而,落叶松胚性组织因长期继代培养存在胚性组织转变为非胚性组织的现象,且存在原胚发育质量不高、发生数量低、难以同步化等问题。因此,从分子水平研究体细胞胚发生发育表达调控机制,揭示体细胞胚发生发育机理,可为建立高效稳定的体细胞胚发生体系奠定基础。本研究:(1)以日本落叶松胚性细胞系638为实验材料,利用SMART技术构建了落叶松体细胞胚全长cDNA文库;(2)通过454 GS FLX Titanium高通量测序平台,获得了日本落叶松体细胞胚原胚团时期转录组信息,对所得转录组数据进行了相关生物信息学分析及注释。主要结果如下:1.文库构建与分析研究表明,所建初始文库滴度为2.25×10~6pfu/mL,重组率为95.13%,扩增文库滴度为2.65×10~9pfu/mL,插入片段长度主要分布在0.5～2kb之间,平均长度为850bp;说明所构建文库质量高、代表性好,能用于目的基因分离筛选及表达。2.从初始文库中随机挑选16个克隆进行测序,成功测序15个,经去除低质量序列,拼接获得13个unigenes,包括2个contigs和11个singletons,其中3个unigenes有已知功能,2个unigenes具推测功能,2个unigenes功能未知,6个unigenes在蛋白质数据库中无同源序列,结果表明,能从构建的文库中分离得到低丰度表达基因或者落叶松体细胞胚特有的新基因。3.对原胚团时期落叶松胚性细胞系638进行转录组研究显示:(1)1/2的454测序共获得591 759条原始reads,经重头拼接后获得32 321个contigs和38 606条singletons,即70 927条ESTs,去掉小于100bp的EST序列,余65 115条高质量ESTs。表明,454高通量测序技术是目前大规模获得ESTs序列的有效方式。(2)综合Uniprot及CDD比对结果,共31 077条EST序列获得注释。在这些获得注释序列中,6 569条获得了GO分类信息;COG分析表明可被划分为22类。KEGG分析结果表明6 281条ESTs可归为291个KEGG途径。搜寻EST序列的潜在SSR,得到1 121个SSR。(3)与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、毛果杨(Populus trichocarpa)及小立碗藓(Physcomitrella patens)蛋白质数据库的BLASTX比对结果表明,日本落叶松(Larix leptolepis)和毛果杨有更多的同源序列。(4)与PGI9.0及SGI5.0 EST并集数据库、小立碗藓Unigene、拟南芥及水稻Unigene并集、杨树EST数据库的TBLASTX比对表明,裸子植物和被子植物的基因信息有较大的差异,裸子植物的基因序列信息并不能完全从被子植物中得到注释。综上所述,本研究获得大量落叶松体细胞胚转录组信息,这将为发现及鉴别落叶松体细胞胚发育关键基因、基因表达模式、分子标记提供重要基因资源,为进一步揭示落叶松体细胞胚发育发生机理提供科学依据。为解决落叶松体细胞胚在生产应用中出现的问题提供理论基础。本实验结果也表明454高通量测序技术是基因组庞大的非模式物种转录组研究的有效方式。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 表目录
• 图目录
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究目的及意义
• 1.1.3 项目来源与经费支持
• 1.2 全长cDNA 文库构建原理及应用现状
• 1.2.1 全长cDNA 文库的构建方法及原理
• 1.2.2 全长cDNA 文库的应用现状
• 1.3 DNA 测序技术研究及应用现状
• 1.3.1 第一代DNA 测序技术
• 1.3.2 第二代DNA 测序技术
• 1.3.3 第三代DNA 测序技术
• 1.4 针叶树体细胞胚胎分子机理研究进展
• 1.5 研究目标和主要研究内容
• 1.5.1 研究目标
• 1.5.2 主要研究内容
• 1.6 研究技术路线
• 第二章 落叶松体细胞胚胎全长cDNA 文库的构建及初步分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 研究方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 总RNA 及mRNA 的质量
• 2.2.2 mRNA 合成双链cDNA
• 2.2.3 分级分离后双链cDNA
• 2.2.4 cDNA 文库质量鉴定
• 2.2.5 ESTs 的分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 文库质量
• 2.3.2 克隆序列分析
• 2.4 小结
• 第三章 落叶松体细胞胚转录组测序及分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 研究方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 测序及重头拼接
• 3.2.2 序列分析
• 3.2.3 功能注释
• 3.2.4 与其它物种的比对分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 序列分析
• 3.3.2 功能注释
• 3.3.3 SSR 研究
• 3.4 小结
• 第四章 结论
• 4.1 结论
• 4.2 创新点
• 4.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 在读期间的学术研究
• 致谢
• 详细摘要