猪细小病毒VP2蛋白基因重组腺病毒的构建与免疫特性研究

论文摘要

猪细小病毒病是由猪细小病毒（PPV）感染引起的以母猪繁殖障碍为主要特征的病毒性传染病。现已成为猪的一种世界性疾病,给养猪业造成巨大的经济损失。在PPV的结构蛋白中,VP2蛋白是能在动物体内诱导产生中和抗体的主要结构蛋白。因此,VP2蛋白基因是研究PPV基因工程疫苗的主要目的基因。本研究的目的是把VP2基因克隆入腺病毒表达载体系统中,构建成重组腺病毒使VP2蛋白基因在重组腺病毒中获得表达,并在仔猪体内进行免疫特性研究,为研究PPV重组腺病毒疫苗奠定基础。1.根据GenBank中的PPV基因序列（NC001718）设计一对引物,用PCR技术从国内分离的PPV弱毒株NADL-2中获得大小为1816bp包含VP2蛋白基因全长的PCR产物,经纯化后与穿梭载体pShuttle-CMV连接,连接产物转化DH5α,将鉴定正确的重组质粒pShuttle-CMV-VP2线性化后与骨架载体pAdEasy-1经电转化在大肠杆菌菌株BJ5183中进行同源重组。在具有卡那霉素的LB平板上筛选阳性菌落,然后用PacⅠ酶对重组质粒进行酶切鉴定,结果与预计的相符,阳性重组质粒命名为rAd-vp2。鉴定的重组质粒rAd-vp2大量提取,PacⅠ酶切线性化,阳离子脂质体法转染到HEK293A细胞,于37℃培养6天后出现细胞病变,收获病毒。经噬斑纯化,用RT-PCR、间接免疫荧光试验（IFA）Western-blotting和电镜观察鉴定VP2基因的转录和表达,结果表明重组腺病毒中的VP2蛋白基因能够在HEK293A细胞中转录和表达。将重组病毒在293细胞上连续传代至10代,测定病毒滴度,其TCID50均可达1O-12/mL。2.利用PCR技术,扩增VP2基因的一段774bp的DNA片段,克隆到pMD 18-TVector后,再定向克隆到表达载体pET-32a中并转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导后进行SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果显示,结构蛋白VP2基因可在大肠杆菌BL21中高效表达,表达产物的分子量约为45kD,并能被细小病毒阳性血清所识别,表达蛋白以包涵体形式存在。表达产物经His-Bind蛋白纯化试剂盒纯化后包被酶标板,初步建立了检测PPV抗体的ELISA方法。3.将重组腺病毒免疫30日龄的断奶仔猪,同时设定疫苗和空白对照组。采用肌肉注射途径,分别在免疫前和免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d、56d经前腔静脉采血,制备血清。用间接ELISA和血凝抑制试验检测样品中的PPV特异性抗体。结果显示,免疫后7d,抗体水平开始上升,第2周达到高峰,并能持续数周。本研究成功构建了一株重组腺病毒,能稳定表达PPV VP2蛋白基因,仔猪免疫试验证实,该重组腺病毒具有PPV免疫原性。本研究为进一步研制PPV重组腺病毒疫苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 猪细小病毒研究进展
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 PPV 的基因组结构及编码蛋白
• 4 细小病毒的诊断
• 5 疫苗研究进展
• 参考文献
• 第二篇 实验研究
• 第一章 PPV VP2蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第二章 猪细小病毒VP2蛋白基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第三章 PPV VP2蛋白基因重组腺病毒免疫特性研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 全文总结
• 附录:常用试剂的配制
• 致谢