昆虫中肠围食膜靶标蛋白分离鉴定的研究

论文摘要

围食膜（peritrophic membrane,PM）是昆虫中肠天然防御体系,主要由几丁质和蛋白质组成。本研究以农业上重要的鳞翅目夜蛾科害虫甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）为对象,构建其中肠cDNA文库,分离和鉴定新的PM靶标蛋白,明确靶标蛋白的生理功能,探讨PM与病原微生物相互作用的分子机理,寻找生物防治新靶标,将为发展新的高效生物杀虫剂提供理论依据。利用Stratagene公司cDNA合成试剂盒,成功构建了高质量的甜菜夜蛾和棉铃虫中肠cDNA表达文库,原始文库滴度分别为5.51×106pfu/ml和4.82×106pfu/ml,重组率分别为99.97%和99.79%,文库扩增后滴度分别为2.41×109pfu/ml和1.5×109pfu/ml,平均插入片段分别约为1.8kb和2.0kb。提取甜菜夜蛾围食膜蛋白,成功制备了甜菜夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体;过碘酸-希夫试剂（PAS）显色法检测甜菜夜蛾和棉铃虫围食膜和中肠组织蛋白组成,发现围食膜中糖蛋白含量很高,中肠组织中糖蛋白含量低。利用免疫筛选方法,从甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库中筛选得到肠粘蛋白克隆SeI1-120共120个以及围食膜蛋白阳性克隆SeM1-92共92个。其中seⅡM-6,seⅡM-8和seⅡM-20基因均与粘虫肠粘蛋白相似性最高,但5‘端缺少未知的氨基酸序列。SeⅡM-6和SeⅡM-20分别编码4个和3个几丁质结合功能域;SeⅡM-8具有5个几丁质结合功能域（CBD）,一个类粘蛋白结构域和一个在昆虫蛋白中首次发现的天冬氨酸富集区,GenBank登录号为EU047712。利用抗体差异筛选方法,从甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库筛选得到围食膜蛋白阳性克隆SeP1-162共162个。以4.8kb的seP159基因为模板,设计引物,扩增得到包含信号肽和几丁质结合功能域的基因p1226,克隆并表达,Westernbot验证了该蛋白的表达。secbp66基因编码围食膜蛋白,其核苷酸序列GenBank登录号为EU139126。结构域分析表明,SeCBP66具有一个17个氨基酸的信号肽,包含7个几丁质蛋白结合功能域（CBD）,最长读码框（ORF）编码602个氨基酸,与粘虫（Mamestra configurata）围食膜蛋白pcritrophin 1的相似性最高,为48%;构建了携带围食膜蛋白基因secbp66的重组表达载体pQE-SeCBP66,pMal-SeCBP66,pET-SeCBP66,在大肠杆菌中表达140kDa的目的蛋白;构建了SeCBP66重组杆状病毒表达载体,实现了重组病毒在昆虫细胞系的表达;几丁质结合实验表明SeCBP66具有几丁质结合活性;为了研究单个CBD的结构和功能,以secbp66基因为模板,PCR扩增得到携带信号肽和一个几丁质结合功能域的基因cbdl,构建了原核表达载体pQE30-CBDl,Spot blot鉴定在大肠杆菌中表达了目的蛋白;构建CBDl重组杆状病毒表达载体,实现了重组病毒在昆虫细胞系的表达。用粉纹夜蛾肠粘蛋白多克隆抗体,免疫筛选甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库,得到羧酸酯酶基因secl,GenBank登录号为EF580101;构建该基因的原核表达载体pET-secl和pQE-secl,分别在大肠杆菌中获得表达;构建SeCl重组杆状病毒表达载体,实现了重组病毒在昆虫细胞系的表达;以a-醋酸萘酯为底物,检测羧酸酯酶活性为1.3nmol/100μl酶液。从棉铃虫中肠cDNA表达文库中筛选得到编码肠粘蛋白的基因片断hat12,hat15,hat46（haiim-46）和一个编码新的棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM86全长cDNA克隆。这3个基因片断大小分别为1772bp,1728 bp,2857bp;其中haiim-46基因编码的棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM-46,具有3个粘蛋白结构域,8个几丁质结合域,缺少氨基端信号肽序列。Hat50基因全长1487bp,结构域分析其氨基端缺少信号肽序列,具有2个几丁质结合功能域,这2个CBD间有一个甘氨酸-天冬氨酸富集区。编码HaⅡM86的cDNA全长3147bp,包括ORF2,517bp,GenBank登录号为EU136045;结构域分析表明,HaⅡM86N-端带有16个氨基酸的信号肽序列,具有5个CBD,一个粘蛋白结构域,两个甘氨酸-天冬氨酸富集区;这两个甘氨酸-天冬氨酸富集区分别位于第3,第4和第4,第5个CBD之间,第1个甘氨酸富集区中序列CDGSCPDNGGNDGN重复2次,第2个甘氨酸富集区内,序列NDGG重复达20次。该区域同甜菜夜蛾肠粘蛋白SeⅡM-8中的甘氨酸富集区相似,是首次在昆虫蛋白中发现,其在围食膜蛋白结构中的作用还尚未可知。将该粘蛋白基因克隆到原核表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15,Western blot检测其表达了约200kDa的蛋白;构建了携带HaⅡM86基因的重组病毒,实现了重组蛋白HaⅡM86在昆虫细胞中的表达;昆虫杆状病毒系统表达的HaⅡM86具有几丁质结合活性,能够被1%Calcofour洗脱,能够被棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白Enhancin降解。本研究中的一个重要发现是棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白Enhancin能够降解HaⅡM86,这为棉铃虫的生物防治提供了新思路;此外,对棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM86的结构域分析,尤其是甘氨酸-天冬氨酸富集区的发现,扩充了昆虫围食膜蛋白的种类,为探索围食膜的结构和生理功能提供了依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 昆虫中肠围食膜的结构和功能
• 1.2 围食膜蛋白的种类及其特性
• 1.2.1 昆虫肠粘蛋白（ⅡM）
• 1.2.2 几丁质结合蛋白
• 1.2.3 其它围食膜蛋白
• 1.3 围食膜的形成机理及破坏机制
• 1.4 cDNA文库——研究新基因的有效工具
• 1.4.1 cDNA文库简介
• 1.4.2 全长cDNA文库
• 1.4.3 昆虫中肠cDNA文库的构建
• 1.5 本研究的目的意义
• 第2章 甜菜夜蛾和棉铃虫中肠cDNA表达文库的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 mRNA的分离纯化
• 2.2.3 cDNA第一链、第二链的合成
• 2.2.4 cDNA分级分离及定量
• 2.2.5 文库的容量及重组率
• 2.2.6 PCR鉴定文库插入片断大小
• 2.3 讨论
• 2.3.1 高质量的RNA
• 2.3.2 关于载体
• 2.3.3 文库质量
• 2.3.4 文库构建策略
• 2.4 小结
• 第3章 甜菜夜蛾围食膜蛋白的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 抗体
• 3.1.3 缓冲液
• 3.1.4 围食膜的制备
• 3.1.5 甜菜夜蛾五龄幼虫围食膜蛋白抗原及抗体的制备
• 3.1.6 围食膜蛋白的检测（过碘酸-希夫显色法）
• 3.1.7 Western Blot
• 3.1.8 cDNA文库的免疫筛选
• 3.1.9 cDNA序列分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 围食膜蛋白组成分析
• 3.2.2 甜菜夜蛾围食膜蛋白抗体检测
• 3.2.3 利用粉纹夜蛾粘蛋白抗体筛选甜菜夜蛾中肠cDNA文库
• 3.2.4 利用粉纹夜蛾围食膜蛋白总抗体筛选甜菜夜蛾中肠cDNA文库
• 3.2.5 利用粉纹夜蛾粘蛋白抗体和粉纹夜蛾围食膜蛋白总抗体筛选甜菜夜蛾中肠cDNA文库
• 3.3 讨论
• 3.3.1 甜菜夜蛾围食膜蛋白的组成
• 3.3.2 甜菜夜蛾肠粘蛋白的结构特征
• 3.3.3 全长围食膜蛋白基因的克隆和表达
• 3.3.4 文库筛选
• 3.4 小结
• 第4章 甜菜夜蛾围食膜蛋白SeCBP66的分离鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试昆虫
• 4.1.2 昆虫细胞及真核基因表达系统
• 4.1.3 菌株和质粒
• 4.1.4 cDNA文库的筛选
• 4.1.5 序列分析
• 4.1.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4.1.7 原核重组表达载体的构建
• 4.1.8 大肠杆菌的转化
• 4.1.9 重组子的筛选与阳性克隆的鉴定
• 4.1.10 重组子的诱导表达及Western Blot鉴定
• 4.1.11 cbdl基因的克隆和表达
• 4.1.12 昆虫细胞培养基的配制
• 4.1.13 细胞培养方法
• 4.1.14 表达SeCBP66重组杆状病毒的构建
• 4.1.15 表达CBDl重组杆状病毒的构建
• 4.1.16 转染（磷酸钙法）
• 4.1.17 空斑实验
• 4.1.18 再生几丁质（regeneratedchitin）的制备
• 4.1.19 重组蛋白SeCBP66的几丁质结合活性
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 SeCBP66序列分析
• 4.2.2 SeCBP66的原核表达
• 4.2.3 在昆虫杆状病毒系统表达SeCBP66和CBDl
• 4.2.4 SeCBP66蛋白的几丁质结合活性
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第5章 甜菜夜蛾羧酸酯酶SeCl的分离鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 cDNA文库的筛选及SeCl基因序列分析
• 5.2.2 SeCl与几种昆虫羧酸酯酶氨基酸序列的比较分析
• 5.2.3 羧酸酯酶重组载体的构建和表达
• 5.2.4 羧酸酯酶的真核表达
• 5.2.5 羧酸酯酶的活性测定
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第6章 棉铃虫围食膜蛋白的筛选
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 供试昆虫
• 6.1.2 抗体
• 6.1.3 缓冲液及常规试剂
• 6.1.4 围食膜蛋白的检测
• 6.1.5 cDNA文库的免疫筛选及序列分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 利用粉纹夜蛾肠粘蛋白抗体筛选棉铃虫中肠cDNA文库
• 6.2.2 利用粉纹夜蛾围食膜总蛋白抗体筛选棉铃虫中肠cDNA文库
• 6.2.3 利用甜菜夜蛾总围食膜蛋白抗体筛选棉铃虫中肠cDNA文库
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第7章 棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM86的分离鉴定
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 供试昆虫及细胞系
• 7.1.2 cDNA文库的筛选及序列分析
• 7.1.3 原核重组表达载体的构建
• 7.1.4 重组子的鉴定,诱导表达及Western Blot鉴定
• 7.1.5 利用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达肠粘蛋白HaⅡM86
• 7.1.6 重组病毒HaⅡM86的几丁质结合活性以及在不同试剂中的离解性
• 7.1.7 HaⅡM86特异抗体的制备
• 7.1.8 棉铃虫（H.armigera）幼虫中HaⅡM86蛋白的定位
• 7.1.9 经昆虫杆状病毒增效蛋白（Enhancin）处理的HaⅡM86蛋白的检测
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 编码新围食膜蛋白HaⅡM86的cDNA的鉴定
• 7.2.2 HaⅡM86蛋白的原核表达
• 7.2.3 表达HaⅡM86重组杆状病毒的构建
• 7.2.4 重组杆状病毒的表达
• 7.2.5 棉铃虫（H.armigera）幼虫中HaⅡM86蛋白的定位
• 7.2.6 重组病毒HaⅡM86的几丁质结合活性
• 7.2.7 昆虫杆状病毒增效蛋白（Enhancin）对HaⅡM86蛋白的降解作用
• 7.3 讨论
• 7.3.1 棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM86的序列特征
• 7.3.2 HaⅡM86蛋白的表达
• 7.3.3 发现意义
• 7.3.4 从多克隆抗体库快速分离高特异性抗体的方法
• 7.4 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢