Ⅱ型菊酯类农药广谱特异性抗体的制备和多残留免疫技术建立

论文摘要

拟除虫菊酯类农药由于具有较高的杀虫活性和低的哺乳动物毒性,被广泛应用在农业、林业、畜牧业及家庭卫生中。尽管拟除虫菊酯类农药对于人类是相对安全的,但如果拟除虫菊酯类农药大量的暴露,则会引起对人类免疫系统的危害,如造成淋巴结和脾脏的伤害甚至于癌变,因为这些潜在危害的存在,建立一种灵敏、快速、有选择性的拟除虫菊酯类农药残留检测方法是十分必要的。免疫学检测技术是农药及其代谢物重要的快速分析方法之一,具有灵敏度高,特异性强等特点。本文进行了Ⅱ型菊酯类农药免疫学检测技术的研究,主要研究结果如下:1.利用高锰酸钾氧化,将氯氰菊酯原药分子结构中环丙烷部分的双键结构打开,引入-COOH活性基团,设计合成了模拟氯氰菊酯特征结构的半抗原（RS）-α氰基-3-苯氧基苄基（RS）-cis,trans-2,2-二甲基-3-羧基-环丙烷羧酸酯;利用活性酯法将半抗原与牛血清蛋白和卵清蛋白进行偶联,制备人工抗原。半抗原通过核磁共振、红外光谱扫描、高分辨质谱等鉴定,人工抗原通过紫外吸收扫描法鉴定,证明半抗原和人工抗原均为设计所需产物。2.以半抗原-BSA和半抗原-OVA作为免疫原,免疫新西兰大白兔,获得了多克隆抗体,经间接非竞争ELISA法检测表明以半抗原-BSA免疫兔子制备的抗血清效价达1:25600,利用方阵滴定法确定了包被原与抗血清的工作浓度:包被原的工作浓度为0.5μg/ml,抗血清稀释度为1:12000。3.用抗血清建立了间接竞争ELISA （IC-ELISA）检测方法。确定了IC-ELISA检测方法中助溶剂丙酮的使用量应小于5%。以IC-ELISA法检测免疫原,结果表明该抗体对免疫原有很好的识别作用,免疫原对的抗体的I50为0.048μg/ml。该抗体对小分子农药氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯都有识别作用,特别是对氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯的灵敏度较高,两者的I50分别为1.1553μg/ml和1.7095μg/ml,I10分别为0.0117μg/ml和0.0485μg/ml。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 拟除虫菊酯类农药的残留危害
• 1.2 拟除虫菊酯类农药残留分析检测技术
• 1.2.1 薄层色谱法
• 1.2.2 气相色谱（GC）分析法
• 1.2.3 高效液相色谱（HPLC）分析法
• 1.2.4 色谱-质谱联用法
• 1.2.5 酶联免疫吸附剂测定（ELISA）分析法
• 1.3 免疫技术专论
• 1.3.1 免疫检测分析原理
• 1.3.2 免疫分析技术的一般程序
• 1.4 选题的目的和意义
• 第二章 人工抗原的合成及鉴定
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 试剂材料
• 2.1.2 试验仪器
• 2.1.3 透析袋的准备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 半抗原的合成
• 2.2.2 半抗原的纯化
• 2.2.3 人工抗原的合成
• 2.2.4 人工抗原的的紫外吸收扫描鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 半抗原分子结构的鉴定
• 2.3.2 人工抗原的紫外鉴定结果
• 2.4 讨论
• 第三章 多克隆抗体的制备与鉴定
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 试验仪器
• 3.1.3 试验动物
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 免疫原乳化方法
• 3.2.2 动物免疫方法
• 3.2.3 抗体的分离
• 3.2.4 抗体的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 抗体效价的监测
• 3.3.2 抗体及包被原工作浓度的确定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 免疫方案的设计
• 3.4.2 ELISA 方法的选择
• 第四章 酶联免疫分析检测方法的建立
• 4.1 材料和仪器
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 试验仪器
• 4.1.3 农药标准溶液
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 间接竞争ELISA（IC-ELISA）的建立
• 4.2.2 有机溶剂对IC-ELISA 检测的影响
• 4.2.3 IC-ELISA 敏感度及特异性的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 间接竞争ELISA（IC-ELISA）的建立
• 4.3.2 有机溶剂对IC-ELISA 法的影响
• 4.3.3 抗体敏感度及特异性的检测
• 4.4 讨论
• 4.4.1 有机溶剂的选择
• 4.4.2 抗体敏感度及特异性分析
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢