IHHNV和LCDV实时定量PCR检测方法的建立与应用

论文摘要

传染性皮下及造血器官坏死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV）可感染世界各地养殖对虾,给对虾养殖业造成严重经济损失。本研究首次采用实时定量PCR法对广西地区的84份凡纳滨对虾样品进行检测,同时以常规PCR检测作对照。实时定量PCR检测阳性率为79.8%,常规PCR检测阳性率为40.5%,且常规PCR检测呈阳性的样品均包含在实时定量PCR检测呈阳性之中,也表明广西地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV的感染率较高。将两者检测均呈阳性的30份样品扩增产物进行序列分析测序,测序结果通过DNA STAR软件包进行分析,并通过NCBI Blast与GenBank中的序列进行比对,结果证明测定的是IHHNV序列。30份样品的IHHNV序列很保守,可以分为4种类型,仅有两个碱基的位置发生变异。实时定量PCR检测IHHNV,快速、灵敏、准确,特异性好,可以作为检测对虾感染病毒的有效方法。淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus,LCDV）广泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中,可感染9目34科计140种以上鱼类。淋巴囊肿病是对鱼类危害较为严重的病毒病之一,其感染率可高达80%,死亡率可达30%。本研究建立Taqman、SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法检测淋巴囊肿病毒。选取LCDV的主要衣壳蛋白（major capsid protein, MCP）基因保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。Taqman实时定量PCR中,以梯度稀释的含有LCDV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行灵敏度检测,质粒浓度为3×107 30个拷贝内都有扩增曲线,检测限为30个病毒拷贝。根据病毒拷贝数（X）与Ct值的关系,制备了标准曲线。拷贝数（X）与Ct的关系为:Ct=-3.63lgX+41.86,相关系数R2=0.9915。特异性实验中,Taqman实时定量PCR对流行性造血器官坏死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV）、蛙虹彩病毒（Bohle iridovirus, BIV）、新加坡石斑虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus, SGIV）、真鲷虹彩病毒（Sea bream iridovirus, RSIV）都没有扩增反应。利用建立的方法对我国养殖场的鱼类进行检测,共检测到12批LCDV阳性样品,并利用标准曲线对病毒进行了定量分析。将阳性样品的常规PCR产物进行纯化测序,证实是LCDV序列。Taqman实时定量PCR检测LCDV,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,可成为一种早期检测LCDV的新方法。SYBR GreenⅠ实时定量PCR中,优化了定量PCR的反应条件,反应体系的最佳引物浓度为0.5μM。该方法能特异检测出淋巴囊肿病毒,不能扩增流行性造血器官坏死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV）、虎纹蛙病毒（Tiger frog virus, TFV）、蛙虹彩病毒（Bohle iridovirus, BIV）、新加坡石斑虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus, SGIV）、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）及真鲷虹彩病毒（Sea bream iridovirus, RSIV）。利用该方法对12份发病牙鲆鱼样品进行检测,均呈阳性。重复性测试中,SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测LCDV质粒DNA显示出很好的批内重复性和批间重复性。建立的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法用于LCDV的检测具有成本低、特异、灵敏、重复性好等优点,同样可成为一种早期检测LCDV的新方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）的研究概述
• 1.2 淋巴囊肿病毒（LCDV）的研究概述
• 1.3 鱼虾类病毒病检测与诊断技术
• 1.4 实时定量PCR 技术及其在水生动物病原体检测方面的应用
• 2 常规PCR、实时定量PCR检测IHHNV的效果分析
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 TaqMan 探针、SYBR GreenⅠ实时定量 PCR 检测 LCDV
• 3.1 TaqMan实时定量PCR检测LCDV
• 3.2 SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测LCDV
• 3.3 小结
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文