胞外DNA结合蛋白SAP调控DNA免疫识别的机制及其应用研究

论文摘要

DNA作为最重要的遗传物质，一直以来受到遗传学和基因工程研究的关注。通过DNA的人工操作和导入进行的基因治疗和核酸疫苗，也是医学遗传学范畴下的重要研究领域之一。然而，大量前期实践证实，人体的基因治疗和核酸疫苗的效果并不理想，并与小鼠等模式生物中的研究结果差别很大。这部分提示了人体内可能存在限制DNA导入和基因治疗的某些机制，从而影响了目前DNA介导的基因治疗的发展。针对这些抑制性机制进行研究，无疑对于基因治疗和核酸疫苗的发展具有重要意义。近年来研究表明，DNA也是人体免疫系统识别和清除的重要成分。外源性的核酸物质，包括感染病原体的核酸组分，人工合成的核酸片段和模拟分子等，还是内源性的核酸物质，包括人体自身的体液循环核酸，细胞凋亡小体内的DNA片段等，均可以成为免疫系统的识别对象，并引起强烈的先天免疫反应和抗原特异性免疫反应。在临床疾病方面，DNA免疫识别的异常可以引起SLE，干燥综合症，银屑病等多种自身免疫性疾病，而另一方面，DNA作为一种免疫调节剂，在肿瘤，感染性疾病中早有应用，而携带特定基因的DNA载体，又在DNA疫苗和基因治疗领域有着广泛的应用。因此，研究DNA的免疫识别机制，不仅可以对免疫和炎症相关疾病的发病机制有着更深层次的认识，更可以为DNA佐剂和DNA为基础的基因疫苗和基因治疗研究增加理论基础，并为其应用研究开拓新的方向。基于以上背景，本论文从以下几个方面进行了研究：第一部分：胞外DNA结合蛋白SAP对DNA先天免疫识别的调控机制研究我们首先根据人和小鼠对DNA反应性的显著物种差别，提出了人体内可能特异性存在某些DNA清除及负向调控分子的假设。通过DNA结合蛋白质免疫沉淀偶联质谱鉴定的技术筛选了人和小鼠的差异性DNA结合蛋白，结果发现，人血清中主要的DNA结合蛋白为血清淀粉样蛋白P物质(SAP)，而小鼠中不存在结合DNA的SAP蛋白。经过采用D0t—EIA和EMSA对SAP DNA结合活性的验证，证实了SAP是主要的物种差异性DNA结合蛋白。SAP结合DNA不依赖于DNA大小，构象和结构，并且可以被一种SAP抑制剂cHPHc通过改变其天然五聚体结构而破坏。我们进一步探讨了SAP结合DNA后对DNA降解，DNA入胞等生理过程的影响。我们发现了SAP可以促进DNA被人和小鼠巨噬细胞吞噬，而且这种吞噬的效率很高，吞噬的DNA定位于早期内体，但未在晚期内体分布，且降解迅速，降解过程可以被氯喹阻断，提示DNA吞噬后进入早期内体，并在内体酸化过程中降解。进一步研究发现DNA在无SAP存在的情况下，主要是通过胞巨饮途径摄取，且依赖分子主要为HMGBl，LL37等，而SAP存在下主要通过受体介导的胞吞途径，且主要的依赖受体为Fc Y受体(FcYRS)和清道夫受体。SAP可以对HMGBl，LL37等分子有竞争性抑制作用。因此，我们提出了SAP可以改变DNA的摄取途径和DNA的胞内代谢过程，抑制DNA进入胞浆的转染过程而促进其在内体中的降解。随后，我们探讨了SAP介导的DNA入胞对DNA先天免疫识别的影响。SAP可以显著地抑制DNA诱导的巨噬细胞激活，表现为细胞因子和趋化因子分泌大大减少，而且可以抑制TLR9下游的NF—KB，RIG—I、DAI下游的IRF3转录因子的激活。为了探讨SAP的抑制DNA免疫功能在正常生理条件下有无意义，我们在体内外模拟正常人生理环境进行研究，采用SAP的抑制剂cHPHc进行干予页后以DNA进行刺激。结果发现SAP生理条件下可以抑制DNA诱导的免疫激活，而cHPHc处理可以消除SAP的抑制作用，恢复DNA诱导的先天免疫反应。这充分提示了SAP对先天免疫反应的负向调控作用及其生理意义。第二部分：SAP对DNA先天免疫识别的影响机制在核酸疫苗和肝脏疾病领域中的应用研究核酸疫苗是重要的新型疫苗，但是其免疫效力在人体实验中很不理想，且其机制尚不明确。鉴于SAP的上述对于SAP与DNA转染和DNA先天免疫激活的关系，我们设想SAP可能是限制核酸疫苗体内免疫效力的关键性因素。我们首先通过疫苗接种组织的病理学研究证明了SAP在接种肌肉，引流淋巴结均有分布。在体内研究中，我们首先采用了人SAP和DNA的复合物联合注射的策略，验证了SAP对DNA免疫原性的影响；随后构建了人SAP转基因小鼠模型，进一步研究在转基因小鼠上验证了DNA疫苗免疫原性下降的现象。进一步采用SAP抑制剂cHPHc作为佐剂，发现DNA疫苗的免疫原性显著提高。进行综合上述理论，我们提出了SAP在人类接种核酸疫苗中可能使得部分核酸疫苗被灭活，抑制其活性，是一种针对外源核酸物质的防御机制的假设。cHPHc作为SAP抑制剂，有可能有力地改善核酸疫苗的免疫效力。肝脏炎症和肝癌研究存在着重大的临床意义。但是肝脏炎症，肝细胞再生及肝癌发生之间的相互关系仍然是扑朔迷离。我们设想了细菌和病毒来源的DNA可能对于肝脏内的先天免疫激活有着重要意义，研究发现肝细胞内存在着DNA的识别受体RIG—I，并且DNA可以跨膜进入肝细胞，激活RIG—I下游的IRF3信号分子。这一摄取过程也与SAP的存在有关。这一机制对于细菌成分和DNA病毒引起的肝脏炎症机制有着重要的意义。我们还进一步发现HBxAg对SAP介导的DNA识别具有抑制性作用，并对HBxAg诱导的基因表达改变进行了系统性分忻，这些机制在肝炎发生发展中可能具有重要意义。在肝癌研究中，我们也发现了SAP在肝癌微环境中的聚集现象，提示了SAP介导的DNA先天免疫激活对肝癌和肿瘤炎性微环境中的可能意义。总之，本研究从细胞外的DNA结合蛋白及DNA诱导的宿主系统性反应入手，对DNA的入胞过程和先天免疫激活负向调控机制反应进行了系统研究，提出了DNA免疫识别的paSSor arreSt假说。我们认为细胞外存在着DNA的抑制性调控分子，并证实SAP可能是其中的关键成分，并且具有物种差异性。当SAP以较高浓度存在于细胞外环境时，DNA被SAP所结合并抑制其免疫激活属性，即SAP"arrest"DNA;而当某些环境下HMGBl及LL37等蛋白分泌增多，DNA可以被其携带，穿过即“paSS”SAP屏障并进一步被先天免疫细胞尤其是巨噬细胞和Dc细胞识别。该假说系统地分忻了DNA免疫识别的细胞外蛋白调控机制。我们进一步探讨了这一机制在核酸疫苗免疫，肝脏炎症反应和肝癌微环境中的意义，重点探讨了SAP蛋白对核酸疫苗活性的影响及其重要意义，提出了SAP可能是限制人类核酸疫苗免疫效力的因素之一。研究拓展了对DNA免疫识别机制的调控网络的认识，并为治疗性核酸疫苗，肝炎和肝再生，肝癌等领域提供了新的研究方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一部分 胞外蛋白SAP调控DNA免疫识别的机制研究
• 前言
• 第一章 DNA的胞外结合蛋白筛选：SAP的发现
• 第二章 SAP对DNA摄取和清除的影响机制
• 第三章 SAP对DNA色天免疫识别的影响机制
• 第二部分 DNA免疫识别调控机制的应用研究
• 前言
• 第四章 SAP对核酸疫苗免疫效力的影响及意义
• 第五章 DNA识别调控机制在肝脏疾病中的意义
• 总结
• 附录
• DNA色天免疫识别的机制研究进展（综述）
• 参考文献
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
• 致谢