猪BMP7基因外显子和内含子多态性检测及其与繁殖性状关系的研究

论文摘要

骨形态发生蛋白7（BMP7）是BMP家族成员之一,具有多方面的生物学活性,对动物繁殖机能具有重要的调控作用。目前在国内外尚未见到猪BMP7基因遗传多态性分析的文献报道。本研究首次对猪BMP7基因编码部位和内含子区域的遗传变异特性及其与猪繁殖性状相关性进行了分析。首先提取猪毛囊基因组DNA,构建DNA池,进行全基因测序,对猪BMP7基因的遗传变异位点进行筛选。在此基础上,应用PCR-RFLP技术,对3个品种258头猪BMP7外显子及内含子区的2个微卫星STC、STA,5个SNP位点T98C、T143C、T20C、T34C、T75C进行群体遗传学分析,并用SPSS16.0分析这7个多态位点对猪繁殖性状的影响。主要研究结果如下:（1）构建了猪毛囊提取的基因组DNA池,进行极端性状混合DNA池测序,首次发现在外显子区存在14个多态位点,在内含子区存在72个多态位点。在内含子1区存在6给微卫星。（2）对内含子1中存在的6个微卫星中的2个通过PAGE凝胶电泳进行多态性检测及分析,并将这2个微卫星做了群体内和不同品种间遗传分析及不同基因型与繁殖性能做了关联性分析。分析结果表明,STC位点有2种基因型,呈低度多态（0.231）,不同猪品种间基因型差异极显著（p=0.006<0.01）;在STA位点发现5种基因型,呈中度多态（0.391）,不同猪品种间基因型差异极显著（p=8.07E-14<0.01）。关联分析发现STC位点对猪的繁殖相关的性状没有显著的影响。STA位点对猪总产仔数具有显著影响（p=0.05）,其中AC型个体的各繁殖性状均值均大于其他基因型个体。2位点组合基因型中,AB/AC型个体的各项与繁殖性状相关的指标与其他基因型之间存在一定差异,表明这2个微卫星位点存在一定的互作。在对STC位点分型过程中发现,STC位点杂合子个体在PAGE胶上,除2条目的条带外,在胶孔的一端还有2条非目的条带。初步推测,这2条非目的条带可能为杂合子在PCR扩增过程中形成的异源双链。（3）以极端性状混合DNA池测序结果为基础,应用PCR-RFLP技术首次检测外显子2中2个SNP位点T98C、T143C和内含子2中3个SNP位点T20C、T34C和T75C。测序结果表明这5个SNP位点均为T/C突变,5个位点都有2个等位基因,3种基因型。遗传变异分析发现,T98C位点A是优势等位基因（0.657）,优势基因型为AB型（0.500）,该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,多态信息含量（PIC）、杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）分别为0.349、0.451、1.821,属中度多态,不同猪品种间基因型差异不显著（p>0.05）。T143C位点D是优势等位基因（0.607）,优势基因型为DD型（0.426）,该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,PIC、He、Ne分别为0.363、0.477、1.913,属中度多态,不同猪品种间基因型差异极显著（p=7.39E-6）。T20C位点E是优势等位基因（0.777）,优势基因型为EE型（0.647）,该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,PIC、He、Ne分别为0.286、0.346、1.530,属中度多态,不同猪品种间基因型差异极显著（p=2.47E-4）。T34C位点G是优势等位基因（0.624）,优势基因型为GH型（0.450）,该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,PIC、He、Ne分别为0.359、0.469、1.884,属中度多态,不同猪品种间基因型差异极显著（p=5.71E-5）。T75C位点J是优势等位基因（0.822）,优势基因型为JJ型（0.822）,该位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,PIC、He、Ne分别为0.250、0.293、1.414,属中度多态,不同猪品种间基因型差异不显著（p>0.05）。（4）将检测到5个SNP位点与繁殖性状相关的生产数据进行关联分析。结果显示,T98C、T34C、T75C在猪总产仔数、产活仔数、出生窝重和21日龄窝重表现为差异不显著。对T143C位点和T20C位点进行关联分析,结果表明,T143C位点在猪繁殖性状21日龄窝重上表现为差异显著（p=0.025<0.05）,该位点主要以加性效应起作用,CC型个体21日龄窝重比DD型个体重3.484kg,差异显著（p<0.05）。T20C位点在猪产活仔数和出生窝重表现为差异显著（p<0.05）,对21日龄窝重各基因型间差异极显著（p=0.000<0.01）。E、F等位基因之间存在超显性效应,该位点主要以显性效应起作用,其中EF型个体产活仔数比EE型个体多0.429头（p<0.05）;EF型个体出生窝重比EE型个体重0.754kg （p<0.05）;EF型个体21日龄窝重比EE型个体重4.385kg （p<0.01）。在猪的选育过程中,对于产活仔数、出生窝重和21日龄窝重可以考虑在T20C位点杂种优势的利用。基于以上结果,可得出如下结论:（1）猪BMP7基因所测序部分共筛选到多态位点92个。包括6个微卫星、7个Indel、79个SNP,该基因遗传变异丰富,可能对基因表达乃至表型产生较大的影响。（2）在所鉴定的7个位点中,STA、T143C、T20C 3个位点与猪若干繁殖性状显著关联,可望作为分子标记用于育种中的辅助选择。

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致谢

摘要

Abstract

文献综述

1 骨形态发生蛋白7（BMP7）的研究进展

1.1 BMP7 基因的结构特点

1.2 BMP7 基因的受体及信号传递

1.3 BMP7 基因的调节作用

2 BMP7 基因的生物学作用

2.1 BMP7 基因在胚胎发育过程中的作用

2.2 BMP7 基因在动物繁殖过程中的作用

3 BMP7 基因的应用前景

4 生物多态性分子遗传标记

4.1 限制性片段长度多态性

4.1.1 限制性片段长度多态性原理

4.1.2 限制性片段长度多态性技术特点

4.1.3 限制性片段长度多态性技术的应用

4.1.4 限制性片段长度多态性技术的影响因素

4.2 微卫星DNA（Microsatellite DNA）标记

4.2.1 微卫星分析原理

4.2.2 微卫星标记特点

4.2.3 微卫星技术的应用

4.3 单核苷酸多态性标记

引言

第1章猪BMP7 基因多态位点的筛选

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

1.1.1.1 试剂

1.1.1.2 主要仪器

1.1.1.3 溶液配制

1.1.2 方法

1.1.2.1 猪毛囊基因组DNA 的提取

1.1.2.2 DNA 质量检测

1.1.2.3 DNA 池构建

1.1.2.4 猪BMP7 基因多态位点的筛选

1.2 结果与分析

1.2.1 DAN 质量检测结果

1.2.2 猪BMP7 基因DNA 池测序

1.3 讨论

1.3.1 毛囊提取DNA 的优点

1.3.2 毛囊数的选择

1.3.3 采样时间的选择

1.4 小结

第2章猪BMP7 基因微卫星多态性检测与分析

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 试剂

2.1.1.2 主要仪器

2.1.1.3 溶液配制

2.1.2 方法

2.1.2.1 引物设计

2.1.2.2 PCR 扩增

2.1.2.3 PAGE 凝胶的制备（29：1，12%）

2.1.2.4 PAGE 凝胶电泳

2.1.2.5 银染

2.1.2.6 遗传多态性的统计学分析

2.2 结果与分析

2.2.1 BMP7 内含子1 中2 个微卫星位点PCR 扩增产物的检测及PAGE 凝胶电泳

2.2.2 内含子1 微卫星的遗传特征分析

2.2.2.1 群体内遗传变异分析

2.2.2.2 猪BMP7 基因内含子1 微卫星座位多态性与繁殖性状的相关性分析

2.3 讨论

2.3.1 微卫星座位的多态性

2.3.2 内含子1 微卫星多态性与繁殖性能的关系

2.3.3 微卫星基因型判型

2.4 小结

第3章猪BMP7 基因SNP 多态性检测与分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.1.1 试剂及酶

3.1.1.2 主要仪器

3.1.1.3 溶液配制

3.1.2 方法

3.1.2.1 引物设计

3.1.2.2 猪BMP7 基因SNP 位点PCR 扩增

3.1.2.3 猪BMP7 基因SNP 位点 PCR-RFLP 分型及测序

3.1.2.4 遗传多态性的统计学分析

3.2 结果与分析

3.2.1 猪BMP7 基因SNP 位点PCR 扩增结果

3.2.2 猪BMP7 基因SNP 位点PCR-RFLP 分型及测序

3.2.3 猪BMP7 基因SNP 的遗传特征分析

3.2.3.1 群体内遗传变异分析

3.2.3.2 猪BMP7 基因外显子2、内含子2 多态性与繁殖性能分析

3.3 讨论

3.3.1 SNP 位点在群体内的遗传变异分析

3.3.2 猪BMP7 基因外显子2、内含子2 多态性与繁殖性状的关系

3.3.3 基因多态性的生物学作用

3.4 小结

结论及进一步研究内容

1 结论

2 需要进一步开展的工作

创新点

参考文献

猪BMP7基因外显子和内含子多态性检测及其与繁殖性状关系的研究

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