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唐鱼三个分子伴侣基因的克隆及重金属对其mRNA表达的影响

2020-12-15阅读(812)

唐鱼三个分子伴侣基因的克隆及重金属对其mRNA表达的影响

论文摘要

本文以唐鱼（Tanichthys albonubes）为研究对象,开展了其热休克蛋白（Heat shock protein, HSP）基因家族HSP60、HSP70以及HSP90三个成员的克隆,组织表达以及不同浓度的重金属（铜和镉）暴露下的表达等研究工作。结果如下：1 HSP60、HSP70和HSP90基因cDNA全长的克隆与分析采用同源克隆和RACE技术分别克隆了这三个热休克蛋白基因cDNA全长序列,TaHSP60 （Genbank登录号：HM234132）序列全长2486 bp,编码一个由575个氨基酸残基组成的蛋白质,具有典型的mt-HSP60特征序列,ATP结合位点,以及C-末端保守的重复区域GGM。TaHSP70 （Genbank登录号：HQ007352）序列全长2398 bp,编码一个由643个氨基酸残基组成的蛋白质,具有3个HSP70家族签名序列（IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和VLVGGSTRIPKIQK）以及C-末端胞质HSP70特征基序EEVD。TaHSP90 （Genbank登录号：HM234131）序列全长2686 bp,编码个由726个氨基酸残基组成的蛋白质,具有5个高度保守的HSP90签名序列（NKEIFLRELISNA[S/A]DALDKIR、LGTIA[K/R]SGT、IGQFGVGFYSA[Y/F]LVA [E/D]、IKLYVRRVFI和GVVDS[E/D]DLPLN[I/V]SRE）以及C-末端胞质HSP90特有的基序MEEVD。2 HSP60、HSP70和HSP90的组织表达分析通过荧光定量PCR技术检测了三个热休克蛋白基因在唐鱼成鱼肝脏、肌肉、鳃、鳍条、眼睛、卵巢、肠道和脑中的表达情况。研究结果显示,HSP60基因mRNA在肝脏中的表达量最高,其次是肌肉组织（约为肝脏的0.67倍,P<0.05）,而鳃中HSP60的表达量最低（约为肝脏的0.04倍,P<0.05）,鳍条中HSP60的表达量为肝脏的0.041倍（P<0.05）,肠道、眼睛、卵巢、肌肉和脑中HSP60 mRNA表达量分别为肝脏的0.45、0.18、0.10、0.67和0.05倍（P<0.05）；HSP70基因mRNA在肝脏中的表达量最高,肌肉组织中mRNA的表达量与肝脏相比无显著差异,其它各组织与肝脏相比均有显著差异（P<0.05）,其中眼睛中的HSP70表达量最低（约为肝脏的0.38倍）,肠道、鳃、鳍条、卵巢和脑中HSP70 mRNA的表达量分别为肝脏的0.60、0.58、0.49、0.42和0.39倍；HSP90基因mRNA在肝脏中的表达量最高,肌肉（约为肝脏的0.98倍）和鳃（约为肝脏的0.85倍）中mRNA的表达平与肝脏相比无显著差异,其它各组织与肝脏相比均有显著差异（P<0.05）,卵巢中的HSP90表达量最低（约为肝脏的0.40倍）,鳍条、眼睛、肠道和脑中HSP90 mRNA的表达量分别为肝脏的0.70、0.49、0.70和0.47倍。3重金属暴露对HSP60、HSP70和HSP90 mRNA表达量的影响利用荧光定量PCR技术检测了重金属铜和镉暴露后HSP60、HSP70和HSP90mRNA表达量的变化。结果表明,不同的热休克蛋白对铜和镉的反应是不一样的,甚至即使是同一家族的热休克蛋白在同一生物体的不同组织中表达也是有差别的。唐鱼暴露于铜和镉中96h均可诱导HSP60 mRNA的表达量显著增加（P<0.05）,且铜对HSP60的诱导强度明显高于镉的诱导强度。13.50μg/L的铜暴露下,唐鱼肝脏和鳃中HSP70 mRNA的表达量无显著变化；27.00 gg/L的铜暴露下,随着暴露时间的延长,96h内唐鱼肝脏和鳃中该基因的表达量呈上调趋势。1.15 mg/L的镉暴露下,肝脏96h内HSP70 mRNA的表达量无显著变化,而鳃中HSP70 mRNA的表达量72h显著上调至峰值（P<0.05）；2.31 mg/L的镉暴露下,肝脏和鳃中HSP70 mRNA的表达量显著上调至峰值（P<0.05）后呈下降趋势,96h表达量显著低于对照组水平（P<0.05）。HSP90的表达水平在铜和镉暴露后也所不同：在肝脏和鳃两组织中,铜暴露后24hHSP90均显著增加,随后呈下降趋势,且在处理后期,鳃组织中该基因的表达显著下调,且显著低于对照组水平（P<0.05）；镉暴露后无论是肝脏还是鳃组织HSP90mRNA的表达均受到明显的抑制作用,且表达量显著低于对照组水平（P<0.05）

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 前言
  • 1 热休克蛋白研究概况
  • 1.1 热休克蛋白的起源
  • 1.2 热休克蛋白的分类
  • 1.3 热休克蛋白在生物体内的分布
  • 1.4 热休克蛋白的基因结构
  • 1.4.1 HSP60的基因结构
  • 1.4.2 HSP70的基因结构
  • 1.4.3 HSP90的基因结构
  • 1.5 热休克蛋白基因的转录、表达和调控
  • 1.5.1 转录水平的调控
  • 1.5.2 翻译水平的调控
  • 1.6 热休克蛋白的生物学功能
  • 1.6.1 伴侣角色
  • 1.6.2 提高生物体的耐受性
  • 1.6.3 生物进化
  • 1.6.4 生物标志物
  • 1.6.5 其它功能
  • 2 热休克蛋白在水产动物应激研究中的应用
  • 2.1 鱼类热休克蛋白的研究进展
  • 2.2 分离基因的常用技术
  • 2.2.1 简并PCR
  • 2.2.2 削减PCR
  • 2.2.3 RACE-PCR
  • 2.3 基因表达的常规分析方法
  • 2.3.1 Northern印迹杂交
  • 2.3.2 RNA酶保护试验
  • 2.3.3 荧光定量PCR
  • 3 研究的目的和意义
  • 第一章 唐鱼热休克蛋白基因cDNA全长的克隆及生物信息学分析
  • 第一节 唐鱼热休克蛋白60基因cDNA全长的克隆及生物信息学分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 实验动物
  • 1.1.2 主要试剂和耗材
  • 1.1.3 主要仪器设备
  • 1.1.4 溶液的配制
  • 1.1.5 培养基的配制
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 RNA提取
  • 1.2.2 cDNA模板制备
  • 1.2.3 引物设计与合成
  • 1.2.4 HSP60简并引物PCR扩增
  • 1.2.5 PCR产物的分离、回收和纯化
  • 1.2.6 回收产物与载体连接
  • 1.2.7 重组质粒的转化
  • 1.2.8 蓝白斑筛选
  • 1.2.9 菌落阳性检测及测序
  • 1.2.10 HSP60 5’末端未知序列克隆
  • 1.2.11 HSP60 3’末端未知序列克隆
  • 1.2.12 cDNA序列生物信息学分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 总RNA提取及HSP60基因中间片段的克隆
  • 2.2 HSP60 5’和3’末端序列的克隆
  • 2.2.1 5’末端序列的克隆
  • 2.2.2 3’末端序列的克隆
  • 2.3 生物信息学分析
  • 2.3.1 HSP60基因cDNA序列分析
  • 2.3.2 基因推导蛋白的分析
  • 3 讨论
  • 第二节 唐鱼热休克蛋白70基因cDNA全长的克隆及生物信息学分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 总RNA提取
  • 1.2.2 cDNA模板制备
  • 1.2.3 引物的设计
  • 1.2.4 HSP70中间片段扩增及克隆
  • 1.2.5 HSP70 5’末端PCR扩增及克隆
  • 1.2.6 HSP70 3’末端PCR扩增及克隆
  • 2 结果与分析
  • 2.1 总RNA提取与HSP70中间片段的克隆
  • 2.2 HSP70 5’和3’末端序列的克隆
  • 2.2.1 5’末端序列的克隆
  • 2.2.2 3’末端序列的克隆
  • 2.3 生物信息学分析
  • 2.3.1 HSP70基因cDNA序列分析
  • 2.3.2 基因推导蛋白的分析
  • 3 讨论
  • 第三节 唐鱼热休克蛋白90基因cDNA全长的克隆及生物信息学分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 总RNA提取
  • 1.2.2 cDNA模板制备
  • 1.2.3 引物的设计
  • 1.2.4 HSP90中间片段扩增及克隆
  • 1.2.5 HSP90 5’末端PCR扩增及克隆
  • 1.2.6 HSP90 3’末端PCR扩增及克隆
  • 2 结果与分析
  • 2.1 总RNA提取与HSP90中间片段的克隆
  • 2.2 HSP90 5’和3’末端序列的克隆
  • 2.2.1 5’末端序列的克隆
  • 2.2.2 3’末端序列的克隆
  • 2.3 生物信息学分析
  • 2.3.1 HSP90基因cDNA序列分析
  • 2.3.2 基因推导蛋白的分析
  • 3 讨论
  • 第二章 唐鱼热休克蛋白基因mRNA组织差异性表达分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 实验动物
  • 1.1.2 实验试剂
  • 1.1.3 实验仪器
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 总RNA提取
  • 1.2.2 DNase Ⅰ处理总RNA
  • 1.2.3 cDNA合成
  • 1.2.4 特异性引物的设计
  • 1.2.5 荧光定量PCR
  • 1.2.6 数据处理
  • 2 结果与分析
  • 2.1 基因组DNA的去除
  • 2.2 特异性引物的筛选
  • 2.3 唐鱼HSP60基因的组织特异性表达
  • 2.4 唐鱼HSP70基因的组织特异性表达
  • 2.5 唐鱼HSP90基因的组织特异性表达
  • 3 讨论
  • 3.1 β-actin基因稳定性检测
  • 3.2 唐鱼热休克蛋白基因mRNA组织表达差异
  • 第三章 重金属暴露对其mRNA表达的影响
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验药品
  • 1.3 实验方法
  • 1.3.1 唐鱼重金属暴露处理
  • 1.3.2 肝脏和鳃组织取样及总RNA提取
  • 1.3.3 Dnase Ⅰ处理总RNA
  • 1.3.4 cDNA合成
  • 1.3.5 荧光定量PCR
  • 1.3.6 数据分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 铜暴露下肝脏中热休克蛋白基因的表达情况
  • 2.2 铜暴露下鳃中热休克蛋白基因的表达情况
  • 2.3 镉暴露下肝脏中基因的表达情况
  • 2.4 镉暴露下鳃中基因的表达情况
  • 3 讨论
  • 3.1 基因组DNA的消除
  • 3.2 β-actin基因的验证
  • 3.3 重金属对唐鱼热休克蛋白基因mRNA表达的影响
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表论文情况
  • 致谢

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