卵巢癌干细胞的分离、培养及其抗原鉴定

论文摘要

目的：采用不同的方法分离培养卵巢癌组织及其细胞系A2780中的卵巢癌干细胞,并通过不同的方法对其进行鉴定,确定其为卵巢癌干细胞,并对其表面抗原进行鉴定,为下一步肿瘤多肽疫苗的研究奠定基础。方法：（1）卵巢癌干细胞的分离、培养：常规消化肿瘤组织,红细胞裂解液裂解红细胞,采用磁珠分选仪分选CD133+卵巢癌干细胞,而后采用无血清干细胞培养液培养卵巢癌干细胞。卵巢癌患者腹水来源肿瘤干细胞分离培养,采用全腹水离心红细胞裂解液裂解红细胞,然后采用干细胞培养液培养卵巢癌干细胞。卵巢癌细胞系来源卵巢癌干细胞的培养,采用干细胞培养基诱导培养。（2）卵巢癌干细胞的鉴定：利用步骤1得到的卵巢癌干细胞进行CD133流式细胞检测和免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞,并通过克隆集落形成实验、传代时间和次数、基质胶分化实验了解卵巢癌自我更新和多向分化能力；体内成瘤实验分别以100及1000个细胞数植入3-4周龄NOD/SCID鼠右腋下,观察肿瘤形成差异。（3）卵巢癌干细胞表面抗原的鉴定：利用定量PCR的方法鉴定卵巢癌和我们所得到的卵巢癌干细胞表面抗原的差异。很多抗原及基因都可能在卵巢癌干细胞中表达,选择更有代表性更有意义的抗原进行鉴定,为下一步抗原表位疫苗的设计的研究打下基础,为临床靶向治疗卵巢癌提供靶分子。结果：（1）组织和细胞株种来源的卵巢癌细胞用干细胞培养液培养。观察细胞大约在3-5天成球并且成悬浮状成长,接种与六孔板中培养,会再次形成50-100个细胞的细胞球,观察细胞成球和克隆集落形成的情况符合干细胞的特征；（2）通过磁性分选得到的CD133+细胞群的CD133表达率达到了82.54%,利用A2780干细胞培养基诱导培养成球后,经过流式细胞仪鉴定CD133表达率约为92.69%；通过免疫荧光、PCR、分化实验、成瘤实验等进一步证明了我们所得到的细胞为卵巢癌细胞；（3）鉴定卵巢癌细胞与卵巢癌干细胞中Sp17、OY-TES-1、LAGE、AKAP3、DPPA2等抗原的表达情况显示,以上抗原在干细胞中的表达均比卵巢癌中的抗原表达高。结论：成功分离了体外培养的卵巢癌细胞中的卵巢癌干细胞、采用了干细胞培养基培养卵巢癌干细胞,并采用了不同的方法从不同方面鉴定了卵巢癌干细胞。进一步对卵巢癌与卵巢癌干细胞的表面抗原表达进行了对比分析,为下一步多肽疫苗的研究打下基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 研究的背景、目的及意义
• 1.1.1 干细胞与肿瘤干细胞
• 1.1.1.1 干细胞定义
• 1.1.1.2 肿瘤干细胞理论
• 1.1.1.3 干细胞与肿瘤干细胞之间的关系
• 1.1.2 卵巢癌与卵巢癌干细胞
• 1.1.2.1 卵巢癌的治疗现状
• 1.1.2.2 卵巢癌干细胞研究进展
• 1.1.2.3 卵巢癌干细胞的分离方法研究现状
• 1.1.2.4 卵巢癌干细胞表面相关分子机制
• 1.1.3 未来的研究方向
• 1.2 研究思路、方法及内容
• 参考文献
• 第二章 卵巢癌细胞株中干细胞的分离培养与鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 主要实验器材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.1.1 A2780卵巢癌细胞的培养
• 2.2.1.2 A2780卵巢癌干细胞的培养
• 2.2.2 流式细胞检测验证卵巢癌干细胞
• 2.2.3 免疫荧光检测
• 2.2.4 A2780干细胞标志物的PCR鉴定
• 2.2.5 肿瘤干细胞的分化
• 2.2.6 成瘤实验
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.1.1 A2780卵巢癌细胞的生长情况
• 2.3.1.2 A2780卵巢癌干细胞的生长情况
• 2.3.2 A2780与A2780干细胞的免疫荧光检测
• 2.3.3 A2780与A2780干细胞的免疫荧光检测
• 2.3.4 A2780干细胞标志物的PCR鉴定
• 2.3.5 肿瘤干细胞的分化实验
• 2.3.6 成瘤实验
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 第三章 人卵巢癌组织中干细胞的分离培养与鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 标本来源
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 实验试剂
• 3.1.4 主要实验器材
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 原代组织的消化处理
• 3.2.2 磁性细胞分选和培养
• 3.2.3 流式细胞检测验证
• 3.2.4 免疫荧光检测
• 3.2.5 免疫组化检测
• 3.2.6 肿瘤干细胞的分化
• 3.2.7 成瘤实验
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 卵巢癌原代组织无血清培养卵巢癌干细胞
• 3.3.2 MACS分选卵巢癌组织标本中的干细胞
• 3.3.3 流式细胞检测验证分选后CD133的表达量
• 3.3.4 卵巢癌干细胞标记物CD133抗原的免疫荧光检测
• 3.3.5 卵巢癌干细胞标记物CD133抗原的免疫组化检测
• 3.3.6 肿瘤干细胞的分化实验
• 3.3.7 成瘤实验
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 第四章 卵巢癌与卵巢癌干细胞表面相关抗原的鉴定
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要实验材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要实验设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.1.1 A2780卵巢癌细胞的培养
• 4.2.1.2 A2780卵巢癌干细胞的培养
• 4.2.2 A2780和卵巢癌干细胞表面抗原Real-Time PCR鉴定
• 4.2.2.1 癌症表面相关抗原的引物合成
• 4.2.2.2 mRNA的提取
• 4.2.2.3 RNA反转录为cDNA
• 4.2.2.4 进行Real-time PCR反应
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 参考文献
• 第五章 结果与展望
• 致谢
• 个人简历、在校期间发表的学术论文及取得的研究成果