论文摘要
内皮细胞功能障碍（Endothelial cell dysfunction,ECD）在糖尿病（Diabetesmellitus,DM）血管并发症的发生和发展中起着重要作用,探求有效的内皮保护策略已受到学术界普遍关注。本研究旨在（1）探讨中国人脂肪组织中硒蛋白S（Selenoprotein S,SelS）基因的表达及其与血清淀粉样蛋白（Serum Amyloid A,SAA）和胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）的相关性,为2型糖尿病（Type 2Diabetes Mellitus,T2DM）及其大血管并发症发病机制和防治研究提供新的方向;（2）应用分子生物学技术分离SelS基因,构建SelS真核表达载体——pLNCX2-SelS,并将其转染至人脐静脉内皮细胞(HUVECs,ECV304细胞),通过DNA序列分析、mRNA及蛋白水平检测进行鉴定,获得高表达SelS的细胞株,为研究SelS的功能提供可靠的技术支持;（3）建立外源性过氧化氢（HydrogenPeroxide,H2O2）刺激诱导的细胞损伤模型,探讨高表达SelS对ECV304细胞的抗氧化保护作用及机制,为T2DM血管并发症的防治建立新的策略和方法。应用RT-PCR技术,检测12例非糖尿病患者及10例T2DM患者大网膜脂肪组织中SelS基因的表达;计算胰岛素抵抗指数（Homa-IR）,ELISA测定血清SAA的水平。结果显示,T2DM患者大网膜脂肪组织中SelS表达水平、Homa-IR及血清SAA水平均高于非糖尿病对照组;并且,在两组的大网膜组织中SelS表达水平与Homa-IR和血清SAA水平均呈正相关。提示中国T2DM患者大网膜脂肪组织表达SelS与IR有关,结合文献报告推测SelS可能是作为SAA的受体在T2DM和大血管并发症的发生发展中发挥作用。取皮下脂肪组织提取总RNA,RT-PCR扩增SelS基因,回收并命名为SelSInsert DNA1。SelS Insert DNA1被克隆至克隆载体pMD18-T,经DNA序列分析鉴定结果无误;将pMD18-SelS质粒进行大量扩增酶切,切胶回收目的基因片段,命名为SelS Insert DNA2。SelS Insert DNA2亚克隆至真核表达载体pLNCX2,经PCR反应以及DNA序列分析鉴定结果,证实真核表达载体pLNCX2-SelS构建正确。将pLNCX2-SelS转染至ECV304细胞,RT-PCR和Western blot检测进一步证实重组SelS真核表达载体pLNCX2-SelS成功表达;同时发现,SelS基因在pLNCX2-SelS转染组的表达水平是ECV304细胞内源性表达水平的1.76倍（mRNA表达）和1.56倍（蛋白表达）。应用不同浓度的H2O2损伤ECV304细胞后,高表达SelS组能显著增加细胞活性、减少H2O2诱导ECV304细胞丙二醛（MDA）的产生、增加超氧化物歧化酶（SOD）的活性、抑制H2O2诱导的窖蛋白-1（Caveolin-1）上调;提示SelS可通过抗氧化作用保护内皮细胞免于H2O2介导的细胞损伤,其保护机制可能与SelS抑制Caveolin-1的上调有关。上述研究表明,内脏脂肪组织SelS高表达与T2DM患者的IR有关,并可能是作为SAA的受体在T2DM和大血管并发症的发生发展中发挥一定的作用;将从人脂肪组织中克隆出的SelS基因片段插入到逆转录病毒载体pLNCX2中,成功构建pLNCX2-SelS重组真核表达载体,并获得SelS高表达细胞株;ECV304细胞中有内源性SelS表达,高表达SelS可以明显减弱H2O2诱导的ECV304细胞的损伤;高表达SelS抗氧化保护ECV304细胞的作用与抑制Caveolin-1上调有关。
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标签：硒蛋白论文; 内皮细胞功能障碍论文; 氧化应激论文; 细胞论文; 窖蛋白论文;