乳酸菌产苯乳酸及分离提取的研究

论文摘要

苯乳酸（Phenyllactic acid, PLA）是一种新型的生物防腐剂,首次发现是在Geotrichum candidum中可以抑制Listeria monocytogens的生长。它具有抗革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌等功能。除了在食品中具有抗微生物的功能外,苯乳酸由于是中药提取物“丹参素”的类似物,具有一定的药用价值,因此苯乳酸的开发和利用具有广泛的应用前景。本论文应用实验室已有的可以发酵生产苯乳酸的乳酸菌Lactobacillus sp. SK007,首先在实验室规模下,对发酵生产苯乳酸的培养基在MRS培养基基础上进行改良,并对发酵培养基成分进行优化;然后进行了300 L发酵罐规模的中试发酵论证实验,绘制了发酵过程曲线,分析了发酵液的主要成分;初步找到使用薄层层析色谱的方法来快速检测苯乳酸;在预处理的基础上,采用离子交换树脂、膜分离、溶剂萃取等方法对苯乳酸发酵液的分离纯化进行探索性研究;系统地对活性炭吸附脱色苯乳酸发酵液进行了研究,分析了脱色的工艺以及活性炭吸附的热力学性质。具体研究内容与结果如下:1.以乳酸菌Lactobacillus sp. SK007作为苯乳酸的生产菌株,在单因素分析的基础上,采用均匀设计、二次旋转组合设计等一系列优化实验,确定了最佳培养基的组成和浓度。乳酸菌SK007发酵产苯乳酸的发酵条件为发酵温度为30℃,发酵时间24 h,培养基起始pH 6.2-6.4,培养基成分为30 g/L葡萄糖,5 g/L苯丙酮酸,47 g/L玉米浆,3 g/L磷酸氢二钾,3 g/L乙酸钠,30 g/L酵母粉和3 mL/L吐温-80,实验结果有良好的重现性,苯乳酸产量达到2.30 g/L。在苯乳酸的发酵生产中使用玉米浆作为主要氮源,而取代了蛋白胨,由于节约了成本,提高了发酵法合成苯乳酸工业化生产的可行性。2.进行了300 L发酵罐规模的中试发酵论证实验,根据发酵进程曲线表明,代谢产物的生成与生长是同步的,即生长偶联型。分析了发酵液的主要成分,分别为苯乳酸3.15% （占固形物含量）,灰分15.55% （占固形物含量）,蛋白质34.15% （占固形物含量）。另外,对发酵液中的苯乳酸进行构型分析,结果表明发酵液中L-苯乳酸和D-苯乳酸的比例接近于1:1。3.采用薄层层析色谱法测定苯乳酸,其具体条件为,展开剂及比例为氯仿:甲醇:冰醋酸= 8: 1: 0.1,显色剂为10%硫酸的甲醇溶液和5%磷钼酸的甲醇溶液。4.利用硫酸铝絮凝等方法先对苯乳酸发酵液进行预处理。然后考察了不同的分离纯化手段对苯乳酸发酵液的影响,其中包括离子交换树脂、膜分离以及溶剂萃取等方法。通过研究表明,采用乙酸乙酯萃取分离效果比较明显,通过正交实验得到最终工艺是相比3: 1,pH为1.0,萃取次数4次。在此工艺条件下,PLA占固形物含量为88.12%,PLA回收率为92.61%。5.研究了4种活性炭对发酵液吸附脱色的影响,最终选择AC1为脱色剂,再通过单因素实验和正交实验对脱色条件进行优化,得到了适宜的脱色条件为:活性炭添加量1.5%,发酵液初始pH6.5,温度为90℃,脱色时间为30 min。在此条件下进行进一步实验,结果发现,苯乳酸发酵液的脱色率可达到90.48%,苯乳酸回收率为88.58%。活性炭对苯乳酸发酵液脱色的吸附符合Freundlich （R2 > 0.9597）方程和Langmuir （R2 >0.9656）方程。吸附焓ΔH为-2.45—6.26 kJ/mol,吸附自由能ΔG为-6.98—-10.69 kJ/mol,吸附熵ΔS为12.6—42.3 J/mol·K。活性炭对苯乳酸发酵液中色素的吸附是自发进行的。

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ABSTRACT

第一章绪论

1.1 苯乳酸的结构及理化性质

1.1.1 苯乳酸的结构

1.1.2 苯乳酸的溶解度和稳定性

1.1.3 苯乳酸的抑菌及药理作用

1.1.4 苯乳酸的安全性

1.2 国内外的研究现状及应用

1.2.1 化学合成法

1.2.2 生物合成法

1.2.3 分离纯化

1.2.4 苯乳酸的应用

1.3 苯乳酸的研究背景及意义

1.4 本课题的研究的目的和内容

第二章薄层层析色谱法分析苯乳酸的研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 主要实验材料

2.2.2 主要实验设备

2.2.3 薄层层析色谱的实验步骤及方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 展开剂的选择

2.3.2 展开剂浓度的选择

2.3.3 显色剂的选择

2.3.4 薄层层析色谱在苯乳酸检测中的应用

2.4 本章小结

第三章苯乳酸发酵工艺研究及物料分析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 主要实验材料

3.2.2 试验仪器

3.2.3 培养基

3.2.4 培养条件

3.2.5 实验方法

3.2.6 测定方法

3.2.7 数据分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 乳酸菌生长曲线的确定

3.3.2 苯乳酸发酵中营养因素主次因素的筛选

3.3.3 主要营养因素条件的确定

3.3.4 300 L 发酵罐放大试验

3.3.5 发酵液成分分析

3.3.6 发酵液中苯乳酸的构型分析

3.4 本章小结

第四章苯乳酸发酵液分离纯化的研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 主要实验材料

4.2.2 主要实验设备

4.2.3 实验方法

4.2.4 分析方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 絮凝实验及絮凝剂的选择

4.3.2 离子交换树脂的分离纯化发酵液

4.3.3 膜分离超滤

4.3.4 萃取

4.4 本章小结

第五章苯乳酸发酵液的脱色工艺及吸附性质的研究

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料及仪器

5.2.2 实验方法

5.2.3 分析方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 检测波长的确定

5.3.2 活性炭的选择

5.3.3 操作条件对脱色效果的影响

5.3.4 正交设计确定脱色的最佳工艺条件

5.3.5 苯乳酸发酵液脱色体系的热力学性能

5.4 本章小结

主要结论与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

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