新型生物传感器在肿瘤细胞及其标志物检测中的应用研究

论文摘要

肿瘤疾病已越来越严重地威胁人类的生命。早期诊断和治疗都依赖于对病源、基因检测和药物的研究,但是早期检测方法操作复杂、价格昂贵、灵敏度与准确性尚需提高。因此,研制基于核酸适体的灵敏快速、简便经济的生物传感器对癌症的预防、诊断和治疗具有极其重要的意义。本论文的主要内容是将化学发光分析技术、电化学发光技术、信号放大技术与核酸分子杂交技术相结合,研制出高灵敏度高选择性的新型生物传感器,对肿瘤细胞及其标志物进行选择性地识别和测定,从而为许多疾病的临床早期诊断提供基础性研究。全文共分为五章:第一章绪论。绪论部分概述了肿瘤细胞及其标志物,介绍了肿瘤细胞及其标志物的分析检测方法以及发展趋势,其中重点介绍了信号放大技术,化学发光法和电化学发光法。第二章基于酶切循环信号放大技术电化学发光传感器检测凝血酶。本章将纳米粒子标记技术和酶切循环信号放大技术结合,研制出一种高灵敏的电化学发光生物传感器。首先将金纳米粒子功能化,联吡啶钌羧基化,制成纳米粒子电化学发光信号探针。同时采用酶切循环技术,产生大量的互补DNA,用于捕获探针。最后以金电极为载体,通过DNA杂交技术,制得电化学发光生物传感器。结果表明:该传感器对凝血酶具有良好的响应,在3.O×10-14～6.0×10-12M范围内,溶菌酶的浓度与发光强度呈良好的线性关系,检出限为1.8×10-14M（3s）。第三章基于酶切循环信号放大技术化学发光生物传感器检测细胞中的溶菌酶。本章以磁性微球,纳米粒子,酶切循环为信号放大技术,以化学发光为检测手段,构建了一种高灵敏、高选择性的生物传感器,用来检测肿瘤细胞中的溶菌酶。此方法首先制备出以异鲁米诺衍生物（ABEI）为发光标记物的ABEI-BSA@Au探针,再以磁珠为载体,经过限制性内切酶Nt.AlwI循环放大信号,通过DNA杂交制备生物传感器。溶菌酶浓度在10-12～1.0×10-10-11范围内与化学发光强度成良好的线性关系,检测限达2.0×10-13M（3s）。该传感器在生物样品中表现出了良好的选择性和良好的检测能力。通过对巨噬细胞,K562细胞和B淋巴瘤细胞中溶菌酶的高灵敏检测,表明该法在生物样品分析中有良好的应用前景。第四章基于DNA包埋信号探针技术非标记生物传感器检测肿瘤细胞的研究。本章用DNA包埋信号分子,构建了对肿瘤细胞检测的两种方法-电化学发光和化学发光法,并进行了比较。对于电化学发光法,实验以金电极为载体,首先固定一条含五个重复单元的长链DNA,另外杂交两条短链DNA,再杂交一条细胞适体DNA和联吡啶钌包埋物,通过四条DNA杂交后的三维空间立体框架进行包埋,当加入作为适体的细胞后,信号探针释放出来;对化学发光法,实验以磁珠为载体,Luminol为信号分子,以DNA杂交后的空间立体框架进行包埋,该法用化学发光手段检测肿瘤细胞识别后的磁珠分离液,实现了对肿瘤细胞的高灵敏度检测。研究发现:前者线性范围为100～1000 cells/mL,检出限为58 cells/mL（3s）。后者线性范围为200～1000 cells/mL,检出限为 126cells/mL（3s）。第五章基于纳米粒子化学发光适体技术检测可卡因的研究。本章探索了建立快速、高灵敏特异检测小分子物质的新方法。实验用化学发光试剂ABEI对功能化金纳米粒子进行标记,形成ABEI-BSA@AuNPs复合物,然后在羧基化的的金纳米表面负载ABEI-BSA@AuNPs复合物和可卡因适体互补序列,得到化学发光探针。以此探针与DNA适体结合,实现了对可卡因的高灵敏测定。在最佳的实验条件下,可卡因的浓度在1.0×10-11～3.O×10-7M范围内与发光强度呈一定的非线性关系,检测限达到3.0×10-12M。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 肿瘤细胞及其标志物
• 1.1.1 肿瘤细胞
• 1.1.2 肿瘤细胞标志物
• 1.2 肿瘤细胞及其标志物的分析检测
• 1.2.1 信号放大技术
• 1.2.1.1 金属纳米粒子
• 1.2.1.2 磁性微球
• 1.2.1.3 酶切循环信号放大
• 1.2.2 化学发光分析法
• 1.2.2.1 化学发光分析方法基本原理及特点
• 1.2.2.2 化学发光与流动注射技术的联用
• 1.2.2.3 化学发光法在生化分析中的应用现状
• 1.2.3 电化学发光分析法
• 1.2.3.1 电化学发光分析方法的基本原理及特点
• 1.2.3.2 电化学发光实验装置
• 1.2.3.3 电化学发光法在生化分析中的应用现状
• 1.2.4 肿瘤细胞及其标志物的其他分析方法
• 1.2.4.1 光学显微镜观察
• 1.2.4.2 生物芯片
• 1.2.4.3 双向电泳技术
• 1.2.4.4 胶体金层析技术
• 1.2.4.5 蛋白质组学技术
• 1.3 肿瘤细胞及其标志物检测方法的发展趋势
• 1.3.1 化学发光分析的发展趋势
• 1.3.2 电化学发光分析的发展趋势
• 1.4 立题依据及主要研究内容
• 第二章 基于酶切循环信号放大技术电化学发光传感器检测凝血酶的研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 实验步骤
• 2.2.2.1 金纳米粒子的制备
• 2.2.2.2 联吡啶钌的合成与活化
• 2.2.2.3 电化学发光探针的制备
• 2.2.2.4 DNA杂交液的制备
• 2.2.2.5 电化学生物传感器的构建
• 2.2.2.6 电化学发光法检测凝血酶
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 实验原理
• 2.3.2 电极表征
• 2.3.3 电化学发光适体传感器的电化学行为
• 2.3.4 实验条件的优化
• 2.3.4.1 凝血酶结合时间的优化
• 2.3.4.2 pH的优化
• 2.3.5 方法的线性范围与检出限
• 2.3.6 电化学发光适体传感器的选择性与稳定性
• 2.4 小结
• 第三章 基于酶切循环信号放大技术化学发光传感器检测细胞中的溶菌酶
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 实验步骤
• 3.2.2.1 金纳米粒子的制备
• 3.2.2.2 BSA@AuNPs纳米粒子的制备
• 3.2.2.3 ABEI-BSA@AuNPs的制备
• 3.2.2.4 化学发光探针的制备
• 3.2.2.5 DNA生物传感器的制备
• 3.2.2.6 溶菌酶的检测
• 3.2.2.7 细胞中溶菌酶的提取
• 3.2.2.8 细胞中溶菌酶的检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 实验原理
• 3.3.2 磁性微球及应用后的TEM表征
• 3.3.3 化学发光适体传感器对溶菌酶的化学发光响应
• 3.3.4 实验条件的优化
• 3.3.5 方法的线性范围及检出限
• 3.3.6 传感器的选择性
• 3.3.7 细胞提取液中溶菌酶的检测
• 3.4 小结
• 第四章 基于DNA包埋信号探针技术非标记生物传感器检测肿瘤细胞的研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 实验步骤
• 4.2.2.1 细胞检测液的制备
• 4.2.2.2 ECL法检测Ramos细胞
• 4.2.2.3 CL法检测Ramos细胞
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 实验原理
• 4.3.2 电极的表征
• 4.3.3 实验条件的优化
• 4.3.3.1 标记物浓度对电化学发光信号的影响
• 4.3.3.2 细胞作用时间对电化学发光信号的影响
• 4.3.3.3 包埋方式的优化
• 4.3.4 细胞工作曲线及方法的检出限
• 4.3.5 传感器的选择性
• 4.4 小结
• 第五章 基于纳米粒子化学发光适体技术检测可卡因的研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器与试剂
• 5.2.2 实验步骤
• 5.2.2.1 化学发光探针的制备
• 5.2.2.2 适体传感器的构建
• 5.2.2.3 Cocaine的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 实验原理
• 5.3.2 流动注射化学发光流路
• 5.3.3 荧光与TEM表征
• 5.3.4 试验条件的选择
• 5.3.4.1 pH对对化学发光信号强度的影响
• O₂浓度对对化学发光信号的影响'>5.3.4.2 H2_O2浓度对对化学发光信号的影响
• 2+浓度对化学发光信号的影响'>5.3.4.3 Co²⁺浓度对化学发光信号的影响
• 5.3.5 检测Cocaine的标准曲线和检出限
• 5.3.6 化学发光适体传感器的选择性和稳定性
• 5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表及待发表的学术论文目录