论文摘要
阿片受体是一类重要的G蛋白偶联受体,是内源性的阿片肽以及许多阿片类药物结合的靶位点。它的激活和信号转导可以调控许多重要的生理功能,如痛觉,应激,免疫应答等。对阿片受体功能调控的研究将为阿片类物质的耐受提供重要的细胞生物学和药理学机制。激动剂诱导的受体磷酸化,内化和细胞内运输不仅可以调控受体的活性、数量和分布,还可以介导受体和不同的信号分子作用,是调控阿片受体的功能的重要机制。以往的研究已经表明,受体的磷酸化参与调控阿片受体的脱敏,内化和复敏等过程。而关于磷酸化在阿片受体细胞内分选中的作用仍不清楚。因此,我们在HEK293细胞中以大鼠μ-阿片受体（MOR）为模型重点研究了激动剂诱导的受体磷酸化在囊泡运输途径相关的阿片受体内化和分选中的作用。我们的研究结果显示:1.缺失Asn362后所有氨基酸残基的MOR突变体MOR362T,在激动剂刺激下的内化程度与野生型受体相比显著减少。而另一个羧基末端3个主要磷酸化位点(Ser363,Thr370,Ser375)被突变成丙氨酸的突变体MOR3A的内化程度与野生型受体相比则差异不大。野生型MOR,MOR362T和MOR3A在激动剂刺激后均可观察到与Rab5阳性囊泡的共定位。此外过表达Rab5鸟苷酸三磷酸化酶的持续激活的突变体可以增加它们的内化,而表达其负显性突变体则抑制它们的内化。这些现象提示:μ-阿片受体羧基端结构对于它的内化是重要的,但是Rab5 GTPase所介导的内化途径并不依赖于MOR的磷酸化。2.羧基端缺失的MOR突变体MOR362T内化后的再循环程度与野生型受体相比大大减少。而另一个磷酸化位点突变的突变体MOR3A,虽然它的再循环程度与野生型受体相比差异不大,但再循环的速度变慢了。此外免疫荧光的结果显示MOR362T在内化后与Rab7阳性的囊泡共定位,而表面生物素标记的实验证显示绝大部分内化的MOR362T被降解了。这提示受体的羧基端结构对于受体的再循环是关键的,它的缺失将导致受体不能进入再循化途径而被降解,而受体磷酸化则调控对受体再循环的动力学。3.进一步的研究发现,野生型MOR的再循环可以被Rab4和Rab11的负显性突变体和小干扰RNA（siRNA）抑制,但是磷酸化缺失的突变体MOR3A的再循环仅被Rab11的负显性突变体和siRNA所抑制,这提示非磷酸化的MOR的再循环专一性的由Rab11介导的囊泡运输途径调控。4.磷酸酶PP1/PP2A的抑制剂冈崎酸（okadaic acid）抑制了野生型MOR的去磷酸化和再循环,而对磷酸化缺失的突变体MOR3A没有作用。此外用MOR特异性的磷酸化抗体检测到:磷酸化的MOR被阻滞在Rab5-或Rab4-阳性的囊泡中,但与Rab11阳性的囊泡则没有共定位。这些数据提示磷酸化的MOR的去磷酸化由PP1/PP2A介导,而且这一过程对于磷酸化的MOR的再循环是必须,也进一步证明磷酸化的MOR的再循环和Rab4介导的囊泡运输途径相关。综上所述,MOR羧基端的磷酸化可以调控受体通过不同的囊泡运输途径进行分选,磷酸化的受体可以通过Rab4介导的囊泡运输途径返回到细胞膜表面,而非磷酸化的受体则通过Rab11介导的囊泡运输途径返回到细胞膜表面,进而导致细胞表面受体复敏的不同。此外,受体在不同的囊泡中可能和不同的信号分子作用,导致磷酸化的和非磷酸化的MORs产生不同的应答并向下游传递不同的信号。