论文摘要
Sry（sex-determining region of the Y chromosome）基因主导哺乳动物雄性性别决定和睾丸的起始发育。转基因鼠证明Sry可以诱导XX型小鼠向雄性发育。Sry蛋白含有一段可以结合DNA的区域,被称为HMG-box。HMG-box在哺乳动物不同物种间相对保守,人SRY HMG-box区域相应位置的点突变可以引起性别反转。对人SRY的亚细胞定位研究结果表明其分布在Sertoli细胞细胞核内,推测其发挥转录因子作用。目前,Sry的表达调控机制依然不清楚。鼠Sry在XY型胚胎生殖嵴Sertoli前体细胞中表达,并受到严格的时空限制,但在其他物种并不十分严格,如人、羊在成年雄性的睾丸内依然可以检测到其表达。虽然已证明Sry具有诱导睾丸发育的功能,但其下游目的基因仍然无法确定。Sox9是Sry可能的下游基因之一。Sf1 （Steroidogenic fator-1）、Gata4 （GATA binding protein 4）、Wt1 （Wilms’tumor gene）、Sox9（Sry-related HMG box-9）、Amh （Anti Mullerian Hormone）和Dax1 （Dosage sensitive sex reversal locus-1）也被证明在性别决定过程中有重要作用。目前关于哺乳动物Sry基因的大量研究主要集中在人和鼠上,在其他动物上的研究较少。牛作为重要的经济动物,在畜牧业生产中具有重要价值,奶牛繁殖时产生的半数雄性牛,经济价值很低,目前采用的性别控制技术,主要是依据X精子和Y精子DNA含量上的微小差别,以流式细胞技术分离,存在价格昂贵,分离效率低,及所分离的精子受精率低等问题。阐明牛性别控制相关基因的调控模式,有希望在分子水平上干扰性别决定的调控网络,可以为奶牛性别控制提供新的思路;也可为哺乳动物性别分化的比较生物学研究填补牛相关数据的空白。本试验对牛Sry基因进行了结构与功能的研究,主要内容包括:克隆了牛Sry基因包含5’侧翼和编码区在内的1838bp序列;原代分离培养牛生殖嵴细胞及卵巢颗粒细胞,并对生殖嵴细胞进行性别鉴定及特征鉴定;利用生物信息学方法预测牛Sry 5’侧翼1066bp内潜在转录起始位点TSS及转录因子结合位点,比较10个物种SRY/Sry蛋白同源性及趋异分化程度,并进行物种进化分析,比较牛及人SRY蛋白的三维结构;构建不同长度的缺失牛Sry 5’侧翼序列调控的报告基因载体,利用荧光素酶双报告基因分析系统在生殖嵴细胞内研究牛Sry核心启动子区域位置;构建了pcDNA3.1-Sry表达载体,在生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中进行了Sry过表达,利用半定量RT-PCR对性别控制相关基因在Sry过表达前后的表达水平变化进行检测,包括Sf1、Gata4、Wt1、Sox9、Amh和Dax1;构建pEGFP-N1-Sry亚细胞定位表达载体,其可以表达融合蛋白（Sry-GFP）,在牛生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中进行了Sry亚细胞定位研究。主要结论如下:1.克隆了牛Sry基因包括5’侧翼及编码区（ORF）在内的1838bp序列,通过测序及序列比对,结果和GenBank中牛Sry序列（No. AB039748.1）完全一致。2.原代分离培养牛生殖嵴细胞,对其进行鉴定表明,此细胞为处于性别分化时期的雄性生殖嵴细胞,在体外生长状态良好,可以稳定传代,为后继研究奠定了基础。3.原代分离培养牛卵巢颗粒细胞,经过在体外传代观察,细胞形态均一,在体外生长状态良好,可以稳定传代,为后继研究奠定了基础。4.对牛Sry5’端1066bp序列的生物信息学分析发现,分别在-93、-419、-722（ATG中A为0点）位置存在三个潜在的转录起始点（TSS）,而且这段区域含有非常丰富的转录因子结合位点信息,这和Sry基因表达的特异性、复杂性相一致。5. 10个物种SRY/Sry蛋白序列比较结果表明,牛和山羊Sry蛋白同源性最高,达到93.5%;牛和小鼠Sry蛋白趋异分化程度最高,达60.4%。6.进化分析表明牛与羊在亲缘关系上最为接近,归为一类,在比较的10个物种中是处于进化最远的亚类,表明偶蹄目动物Sry基因在进化上受自然选择的影响有较大的变异。7.比较牛和人SRY蛋白结构,仅在保守区HMG-box处有较高的相似性,但是空间构象却比较相似,都是通过结合DNA螺旋小沟来识别7个碱基的核心靶序列,作用方式也很相似,说明虽然SRY/Sry蛋白在物种间序列差异较大,但蛋白的结构和作用方式却是很保守的。8.在生殖嵴细胞内,利用双荧光素酶报告基因检测系统,用13个缺失表达载体,对牛Sry5’侧翼1056bp启动子区域进行了细致扫描,结果表明牛Sry核心启动子位于翻译起始位点ATG（A为0点）上游-599-565bp一段35bp大小的区域内。9.利用pcDNA3.1-Sry表达载体在牛生殖嵴细胞内过量表达Sry,用RT-PCR检测性别发育相关基因Sry过表达前后表达水平变化,包括Sf1、Gata4、Wt1、Sox9、Amh和Dax1,结果证明牛Sry对Sox9表达有正调控作用,而其他基因不受Sry过表达影响。10.利用pEGFP-N1-Sry融合蛋白表达载体（Sry-GFP）在牛生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中研究Sry的细胞内分布,结果证明牛Sry蛋白定位于细胞核内,进一步证实其作为转录因子发挥作用。创新点:1.首次利用生物信息学方法对牛Sry基因作全面的生物信息学分析,如结论4-7条,预测分析对牛Sry基因启动子潜在转录起始位点和转录因子结合位点;比较10个物种Sry蛋白序列同源性和分化程度;利用10个物种的Sry序列,对牛Sry基因进行进化分析;对比牛和人的SRY蛋白空间结构。2.首次细致分析了牛Sry基因启动子区域,并将核心启动子定位于翻译起始位点ATG（A为0点）上游-599-565bp一段35bp大小的区域内。3.首次证明牛Sry基因对Sox9基因有正调控作用,证明牛Sry基因可能直接或间接调控Sox9表达。4.首次利用实验证实牛Sry蛋白定位于细胞核。