铜绿假单胞菌内在耐药性相关基因的功能研究

论文摘要

由于长期不合理的使用抗生素,临床中出现了多种耐药性革兰氏阴性菌,其引起的感染已经严重威胁患者的身体健康。铜绿假单胞菌作为这类细菌的代表,其内在耐药性和获得性耐药性使得临床治疗陷入困境,所以针对铜绿假单胞菌内在耐药性的研究显得至关重要。在实验室前期研究中,通过铜绿假单胞菌随机突变体库筛选的方法,得到了43个与抗生素敏感性相关的基因。本研究选取了其中一个重要的敏感性相关基因PA2580和其它实验室筛选出PA4747基因进行了深入研究。本研究通过突变体构建、抗生素敏感性测定、基因转录水平表达测定、蛋白表达纯化、相关毒性因子测定等实验方法,分别研究了上述基因与抗生素敏感性之间的作用关系,探索了基因参与内在耐药性的作用机理,以及基因对致病性相关毒性因子的表达调控和对病原菌其他生理功能的影响。研究结果表明低于抑制浓度的壮观霉素、氯霉素、四环素可能激活PA2580基因表达,突变体对氯霉素、羧苄青霉素和环比沙星的敏感性增加。PA2580基因的功能缺失抑制了过氧化氢酶编码基因katE的表达,此现象直接导致了突变体对H202氧化压力耐受性的降低。PA2580基因还影响III型分泌系统和细菌运动相关毒性因子的表达,其突变体运动表型变化与相关基因表达变化相一致。PA4747基因与铜绿假单胞菌抗生素敏感性相关,突变体的羧苄青霉素和氨苄青霉素MIC分别是野生型PAO1的5倍和2.5倍,同时突变体的运动能力和绿脓菌素的产量也发生了变化。通过测定细胞内外的p-内酰胺酶活性显示MIC上升的主要原因可能是突变体细胞内β-内酰胺酶的过量积累。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略对照表
• 目录
• 图目录
• 表目录
• 第一章 绪论
• 1.1 常见抗生素及作用机理
• 1.1.1 抗生素简介
• 1.1.2 抗生素作用机理
• 1.2 铜绿假单胞菌
• 1.2.1 铜绿假单胞菌的耐药机制
• 1.2.2 耐药性铜绿假单胞菌治疗方法的优化
• 1.3 研究内容和意义
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基的配置
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 高纯质粒小量提取
• 2.2.2 感受态细胞（10B）的制备
• 2.2.3 DNA片段的酶切与连接
• 2.2.4 电转化
• 2.2.5 基因敲除实验
• 2.2.6 基因互补实验
• 2.2.7 细菌菌落计数法
• 2.2.8 结晶紫细菌染色实验
• 2.2.9 抗生素敏感性测定
• 2.2.10 启动子-报道子载体的构建
• 2.2.11 低于抑制浓度的抗生素对目的基因表达的影响
• 2.2.12 PA2580蛋白表达
• 2.2.13 PA2580蛋白纯化
• 2.2.14 绿脓菌素产量测定
• 2.2.15 胞外蛋白酶产量测定
• 2.2.16 弹性蛋白酶产量测定
• 2.2.17 细菌运动能力测定
• 2.2.18 β-内酰胺酶活性测定
• 第三章 实验结果
• 3.1 PA2580基因的功能研究
• 3.1.1 突变体PAO（△PA2580）的构建及互补
• 3.1.2 突变体PAO（△PA2580）生长状况和菌体形态的研究
• 3.1.3 PA2580基因的相关信息
• 3.1.4 PA2580基因与抗生素之间的相互作用
• 3.1.5 PA2580基因与氧化压力的关系
• 3.1.6 PA2580基因对细菌运动能力的影响
• 3.1.7 PA2580基因对Ⅲ型分泌系统的影响
• 3.1.8 PA2580蛋白产物的表达和纯化
• 3.2 PA4747基因的功能研究
• 3.2.1 突变体PAO（△PAsecG）的构建
• 3.2.2 PA4747基因的相关信息
• 3.2.3 PAO（△PAsecG）抗生素敏感性测定
• 3.2.4 β-内酰胺酶活性测定
• 3.2.5 部分毒性表型测定
• 讨论
• 参考文献
• 致谢