论文摘要
目的构建无生物传染危险性且耐RNase的HCV-RNA 1b、2a和6型病毒样颗粒。将病毒样颗粒用于丙型肝炎病毒核酸标准物质和室间质量评价样本的制备,研究其适用性。建立HCV-RNA实时荧光RT-PCR分型（1b、2a和6型）检测方法。方法一、内含HCV RNA部分核酸序列的病毒样颗粒的构建将定量检测试剂盒所检测的区域HCV 5’UTR区和分型检测NS5b区进行overlap连接,并且引入酶切位点。PCR产物进行T载体克隆后用限制性内切酶酶切获得所需要的目的片段,与用酶切后的表达载体相连,构建一新的表达载体。在IPTG诱导下,组装成病毒样颗粒,并验证包装的核酸为HCV reRNA。二、病毒样颗粒在标准物质的研究及室间质量评价中的应用靶值的确定:与国家标准物质同时检测,多点比对定值。稳定性的研究方法:将上述三种不同倍比稀释的质控物置于4℃（对照）、-20℃、室温、37℃、-70℃及-70℃/室温反复冻融3次的条件下保存不同时间观察其稳定性。室间质量评价方法:向全国开展HCV RNA检测的实验室发放5份样本。所有发放的阳性样本的定量结果根据一级定量标准系列确定,对检测结果进行统计分析。三、实时荧光RT-PCR分型检测方法检索已知HCV 1b、2a和6型序列,采用BioEdit软件进行比对,获取HCV 1b、2a和6型序列的保守区域序列。再利用软件Primer Express 3.0进行实时荧光PCR引物和探针设计,初步建立实时荧光PCR检测体系。结果一、内含HCV RNA部分核酸序列的病毒样颗粒的构建成功构建了含有HCV 5’UTR区和NS5b区的三种基因型重组原核表达载体,并转化到BL21-DE3感受态细菌中,得到了可模拟临床样本的HCV RNA病毒样颗粒。二、质控物的稳定性研究以及应用于临床实验室的PCR检测室间质量评价采用三种方法分别对VLPs定值,根据系列国家标准品含量,得到待测样本的浓度。在稳定性实验中将检测组与对照组（4℃）数据分别作t检验,结果表明检验组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。从室间质量评价结果可以看出,整体定量结果与靶值接近,但是不同基因型样本的符合率有所不同。此外,不同试剂和不同仪器检测样本的结果也有差异。三、实时荧光RT-PCR分型检测方法通过序列比对设计了三种HCV基因型特异的探针和引物,建立的基因型特异探针和引物基本能检测出已构建的HCV三种基因型的病毒样颗粒。结论建立了三种不同基因型的病毒样颗粒,在不同条件下放置依然保持良好的稳定性。与目前冻干血清的标准物质相比,同样具有良好的临床适用性。因此可有效地用于临床实验室HCV-RNA RT-PCR检测的室内质量控制、室间质量评价以及分型检测方法评价。初步建立了HCV三种基因型特异探针和引物。今后,对于HCV临床治疗有指导意义,具有良好的应用前景。
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