Heterotypic cell-in-cell结构在炎症、癌症以及病毒感染与传播中相关机制的研究

论文摘要

Cell-in-cell是指一个或多个细胞进到另一个细胞的胞浆内，形成细胞套叠结构的现象。Cell-in-cell可以分为两大类，一类是同种的cell-in-cell（即homotypiccell-in-cell），是指发生在同种细胞之间的细胞进出，另一类是异种的cell-in-cell（即heterotypic cell-in-cell），是指不同种类的细胞之间的细胞进出。本论文研究的是发生在淋巴细胞与肿瘤细胞以及正常细胞之间的heterotypic cell-in-cell。我们通过研究发现：NK92MI、T细胞、B细胞，甚至粒细胞和单核细胞，均可以钻入肿瘤细胞，甚至正常的细胞中，包括分化程度低的干细胞形成典型的heterotypic cell-in-cell结构。这种现象可以跨种系存在，小鼠LAK细胞可以钻入人的表皮癌细胞和乳腺癌细胞中，人的NK细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞亦可以钻入老鼠的黑色素瘤细胞，甚至正常的小鼠成纤维细胞中以及骨髓间充质干细胞。提示heterotypic cell-in-cell是一个很原始的现象，有可能在生物进化过程中起着极为重要的作用。在体内我们阅读了多种癌症患者的病理标本发现癌巢部位比癌旁部位有更多的heterotypic cell-in-cell结构，同时在小鼠肝炎模型中发现相对于正常小鼠，药物诱导肝损伤的小鼠肝脏中可见更多的淋巴细胞进入肝脏细胞形成heterotypiccell-in-cell结构。在体外淋巴细胞进入肿瘤细胞形成heterotypic cell-in-cell结构后的命运是多样化的。大部分淋巴细胞进入肿瘤细胞后会死亡，被肿瘤细胞消化吸收或者排出胞外，小部分淋巴细胞会逃逸出来，其表面的受体或基因型是否变化有待进一步研究，小部分淋巴细胞会在肿瘤细胞内进行有丝分裂，比较有意思的是，部分淋巴细胞还可以攻击并钻入宿主细胞的细胞核内。Cell-in-cell的生物学意义不是很清楚，我们的研究发现淋巴细胞进入肿瘤细胞中，会影响靶细胞有丝分裂后期卵裂沟的形成，导致靶细胞异倍体或者多核的形成。同时在体内的肿瘤芯片中亦观察到该现象。这一发现揭示了heterotypiccell-in-cell很有可能在肿瘤的形成及恶化过程中起着重要的作用。病毒的感染都是有细胞选择性的，例如EBV病毒更容易感染CD21阳性的B淋巴细胞，HIV病毒则易感染CD4阳性的T淋巴细胞，但也有报道体内病毒感染本身不表达受体的细胞，其感染途径一直都不是很清楚。本论文探讨heterotypic cell-in-cell是否介导了病毒感染非易感细胞，我们将带有GFP报告基因的重组EBV病毒感染的人B细胞细胞株Akata同不表达CD21受体的多种非病毒易感上皮细胞共同抚育，观察到Akata可以钻入上皮细胞内并将病毒携带进入上皮细胞并通过检测EBNA1抗原的表达确认上皮细胞成功感染EBV病毒。将HIV阳性的H9/IIIB细胞与CD4阴性的上皮细胞共同培养进一步证明了这种全新的胞内病毒感染方式。利用流式细胞术分离、富集heterotypic cell-in-cell结构，继续培养并用G418筛选，于7天后出现GFP阳性的CNE-2细胞，并通过免疫荧光及透射电镜等技术手段证明发生cell-in-cell的CNE-2细胞最终感染了EBV。rEBV可以通过感染的宿主细胞Akata经cell-in-cell过程将病毒带入CNE-2细胞内，并通过细胞裂解等途径活化和释放rEBV至靶细胞胞浆内，从而产生绿色荧光，释放的病毒可以进一步通过病毒已知机制进入病毒循环生活周期，在CNE-2内建立持续感染并继续通过核融合或基因交换等新机制整合于靶细胞基因组中。Cell-in-cell介导被感染的CNE-2细胞的生物学特征发生显著变化，除了表达病毒抗原以外，同时出现染色体不稳定，极易被诱导成为癌细胞，并且可继续作为一个新生病毒源，继续通过包装释放裸病毒粒子或cell to cell途径继续感染邻近细胞，形成感染岛。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文对照和缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1. Cell-in-cell 结构的研究
• 1.1.1 Cell-in-cell 现象的发现和历史
• 1.1.2 cell-in-cell 的分类
• 1.1.3 cell-in-cell 的生物学意义
• 1.2. Heterotypic cell-in-cell 与炎症、癌症
• 1.2.2 Heterotypic cell-in-cell 与炎症
• 1.2.3 Heterotypic cell-in-cell 与癌症
• 1.3. Heterotypic cell-in-cell 与染色体不稳定性
• 1.3.1 染色体不稳定性的定义与特征
• 1.3.2 染色体不稳定性的形成原因
• 1.4. Heterotypic cell-in-cell 与病毒感染及传播
• 1.4.1 裸病毒（cell free）感染
• 1.4.2 细胞接触（cell to cell）感染
• 1.5. 本课题的目的意义与研究内容
• 1.5.1 目的意义
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 体外 heterotypic cell-in-cell 结构的研究
• 2.1. 前言
• 2.2. 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 Heterotypic cell-in-cell 反应体系的建立
• 2.2.3 Heterotypic cell-in-cell Index 的统计
• 2.2.4 Giemsa 染色方法
• 2.2.5 Heterotypic cell-in-cell 的获得与富集
• 2.2.6 Heterotypic cell-in-cell 结构中多核细胞的统计
• 2.2.7 荧光原位杂交
• 2.2.8 流式细胞仪检测 DNA 含量
• 2.2.9 透射电镜标本制备
• 2.2.10 活细胞工作站观察及追踪 heterotypic cell-in-cell
• 2.2.11 小鼠脾脏 LAK 细胞的分离
• 2.2.12 Transwell 的方法检测细胞的迁移率
• 2.3. 结果与讨论
• 2.3.1 Heterotypic cell-in-cell 的形态学及动力学特征
• 2.3.2 Heterotypic cell-in-cell 普遍存在于淋巴细胞与肿瘤细胞之间
• 2.3.3 Heterotypic cell-in-cell 可形成于淋巴细胞与正常细胞之间
• 2.3.4 Heterotypic cell-in-cell 可形成于不同肿瘤细胞之间
• 2.3.5 Heterotypic cell-in-cell 结构中的效应细胞的命运具有多样性
• 2.3.6 Heterotypic cell-in-cell 结构中的宿主细胞的命运具有多样性
• 2.3.7 Heterotypic cell-in-cell 结构中的宿主细胞大部分是多核细胞
• 2.3.8 Heterotypic cell-in-cell 可导致细胞融合的发生
• 2.4 本章小结
• 第三章 体内 heterotypic cell-in-cell 结构与炎症、癌症相关机制的研究
• 3.1. 前言
• 3.2. 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 小鼠 ConA 诱导肝损伤模型的建立
• 3.2.3 小鼠 PolyI:C 诱导肝损伤模型的建立
• 3.2.4 GVHD 老鼠模型的建立
• 3.2.5 组织标本的处理及 HE 染色
• 3.2.6 透射电镜标本的制作
• 3.2.7 Heterotypic cell-in-cell 的统计
• 3.3. 结果与讨论
• 3.3.1 临床肝炎、肾炎标本中普遍存在 heterotypic cell-in-cell 结构
• 3.3.2 炎症的诱发提高了 heterotypic cell-in-cell 结构的发生
• 3.3.3 药物诱导转基因鼠肝损伤可见更多的 heterotypic cell-in-cell 结构
• 3.3.4 GVHD 小鼠的肝脏、皮肤、大肠及小肠组织中普遍存在 heterotypic cell-in-cell 结构
• 3.3.5 癌症患者的标本中普遍存在 heterotypic cell-in-cell 结构
• 3.4. 本章小结
• 第四章 Heterotypic cell-in-cell 是介导病毒感染非易感细胞的途径之一
• 4.1. 前言
• 4.2. 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 细胞培养方法
• 4.2.3 组织标本处理及 HE 染色
• 4.2.4 免疫组化
• 4.2.5 细胞钻入实验
• 4.2.6 In cell infection CNE-2 细胞的建立
• 4.2.7 免疫荧光
• 4.2.8 Western Blot
• 4.2.9 RT-PCR
• 4.2.10 病毒的获得
• 4.2.11 病毒拷贝数的检测
• 4.2.12 流式细胞仪检测感染率
• 4.2.13 透射电镜标本的制作
• 4.3. 结果与讨论
• 4.3.1 艾滋病感染者肠道部位和鼻咽癌患者的鼻咽部位普遍存在heterotypic cell-in-cell 结构
• 4.3.2 EBV 阳性的 Akata 细胞更易与上皮细胞形成 heterotypic cell-in-cell结构
• 4.3.3 Akata 细胞可钻入 CNE-2 细胞并将 EBV 病毒携带进入 CNE-2 细胞
• 4.3.4 Heterotypic cell-in-cell 可有效介导 CNE-2 细胞感染 EBV 病毒
• 4.3.5 PI3K/AKT 和 1/2 ERK/MAPK 信号通路参与胞内病毒的活化及包装
• 4.3.6 药物抑制 AKT 的磷酸化或 ERK 的磷酸化均可以有效抑制胞内病毒的活化
• 4.3.7 In cell infection 得到的 CNE-2 可包装病毒进而感染易感和非易感细胞
• 4.3.8 Heterotypic cell-in-cell 介导的感染方式也是 HIV 的感染途径之一
• 4.4 本章小结
• 结论与展望
• 结论
• 创新性成果
• 展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件